NF-κB p65对OX-LDL处理的内皮祖细胞增殖活性的影响及机制研究*

刘洁，罗展雄，陈祖平

（柳州市人民医院 心血管内科，广西 柳州 545004）

心血管系统疾病是威胁人类生命健康的主要原因之一，其中血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化发生的基础。内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞，参与内皮组织损伤修复，其在骨髓、脾脏等多种器官中存在，内皮祖细胞可以迁移到外周血并聚集到损伤血管周围促进损伤修复[1]。核转录因子核因子κB（nuclear factor-κB,NF-κB）的重要亚单位之一NF-κB p65，参与炎症、细胞凋亡、细胞生长、氧化应激等过程，在肿瘤、心血管等疾病中扮演重要角色[2]。最近研究显示，内皮祖细胞损伤与NF-кB p65 过度表达有关，在高糖、氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,OX-LDL）等诱导的内皮祖细胞损伤中过度激活[3]。本实验以人外周血内皮祖细胞为实验对象，通过microRNA 干扰技术下调内皮祖细胞中NF-κB p65 的表达，探讨其在OX-LDL 诱导的内皮祖细胞损伤中的作用，为明确动脉粥样硬化发生机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

健康人外周血来自柳州市人民医院。SYBR premix Ex Taq 和Prime Script RT reagent kit 购自大连TaKaRa 公司，引物由生工生物（上海）股份有限公司合成，ECL 发光试剂盒、NF-кB p65 抗体均购自上海碧云天生物技术研究所，丙二醛（Malonaldehyde,MDA）含量检测试剂盒、总超氧化物歧化酶（superoxide orgotein dismutase,SOD）活力检测试剂盒均购自北京Solarbio 公司，活化的Caspase-3 抗体、活化的Caspase-9 抗体均购自美国Abcam 公司，OX-LDL 购自美国Sigma 公司。

1.2 内皮祖细胞分离培养

取健康人外周血，按照密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，按照5×105个/cm2接种细胞种植到纤维连接蛋白包被好的24 孔细胞培养板中，每个孔中加入1 ml M199 细胞培养液，培养液中含有10% 胎牛血清、1% 青链霉素、b-FGF 1 和50 ng/ml 血管内皮生长因子（VEGF），放在饱和湿度、37℃、5%二氧化碳CO2培养箱中培养，4 d 以后更换细胞培养液，添加PBS 洗涤后，贴壁细胞用免疫组织化学检测CD34、VEGFR-2 的阳性表达率均＞90%，CD133 免疫荧光检测其阳性率＞95%，DiI-ac-LDL 和FITC-UEA-1 双染染色阳性率＞90%，鉴定为内皮祖细胞[8]。

1.3 OX-LDL 处理后的内皮祖细胞中NF-κB p65表达水平

取内皮祖细胞，用0.25%胰蛋白酶将细胞配制成单细胞悬浮液，分别用0 和10 mg/L[1]OX-LDL 细胞培养液培养24 h 以后，记为Control 和OX-LDL，用于实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blotting 检测。

1.3.1 qRT-PCR取内皮祖细胞，用细胞总RNA 提取试剂盒分别提取内皮祖细胞的RNA，步骤按照试剂盒说明书标准流程操作。检测其OD 260/280 nm 的比值在1.8 ～2.0。用Prime Script RT reagent kit 逆转录合成cDNA，用SYBR premix Ex Taq 分析NF-κB p65 mRNA 表达水平，反应条件设置为：95℃预变性10 s，95℃退火10 s，60℃延伸30 s，共40 个循环。GAPDH作 为参 照，2-△△Ct法分 析NF-κB p65 mRNA 水 平。GAPDH 引物正向：5'-GGTGAAGGTCGGTGTCAACG-3'，反向：5'-GAGCCCTTCCACGATGCCAA-3'。NF-κB p65 引物正向：5'-AAGATCAATGGCTCACAGG-3'，反向：5'-CCTCAATGTCTTCTTTCTGA-3'。

1.3.2 BCA 法蛋白定量取内皮祖细胞，用移液枪小心将上清吸弃以后，用PBS 将各组细胞洗涤2 次，分别在细胞中添加适量的裂解液，将细胞放在冰上裂解反应30 min，取细胞刮棒将各组细胞裂解液收集到离心管内，4℃高速离心以后，对蛋白进行定量，具体步骤同BCA 蛋白定量试剂盒操作流程。按照每个上样泳道中添加样品40 μg，浓缩胶90 V 电压电泳，分离胶120 V 电压电泳。在200 mA 电流条件下把凝胶上蛋白电转至NC 膜后，用封闭液（5%牛血清白蛋白）将非特异性的位点封闭以后，同NF-κB p65 一抗（1∶200 稀释）置于4℃过夜反应，与HRP 标记的二抗（1∶2 000 稀释）结合2 h。按照增强化学发光法（ECL）发光，用Image J 软件以GAPDH 作为参照分析NF-κB p65 蛋白表达。

1.4 慢病毒感染及细胞分组

内皮祖细胞分为4 组，分别为Control 组、OXLDL 组、siRNA control+OX-LDL 组、NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 组，Control 组和OX-LDL 组处理方法同1.3 部分。siRNA control+OX-LDL 组为感染siRNA Control 阴性对照慢病毒的内皮祖细胞经10 mg/L 的OX-LDL 细胞培养液培养24 h，NF-κB p65 siRNA+ OX-LDL 组为感染NF-κB p65 siRNA 慢病毒的内皮祖细胞经10 mg/L OX-LDL 细胞培养液培养24 h。慢病毒由山东维真生物科技有限公司构建，慢病毒感染方法简述为：内皮祖细胞密度生长为60%时，将原细胞培养液吸弃，加入新鲜的细胞培养液，同时加入8 μg/ml 的聚凝胺，按照MOI 值为10 添加慢病毒颗粒，培养过夜以后，检测GFP 荧光表达情况，感染效率高于90%。OX-LDL 组、siRNA control+OX-LDL 组、NFκB p65 siRNA+OX-LDL 组细胞用qRT-PCR 和Western blotting 检测干扰效果，步骤同1.3 部分。

1.5 MTT 检测细胞增殖

内皮祖细胞种植到96 孔培养板（提前用纤维连接蛋白包被）中，按照Control、OX-LDL、siRNA control+OX-LDL、NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 分组处理培养。取出96 孔培养板，每孔加10 μl MTT，放在37℃静置4 h。将孔内的液体分别吸除掉后，加DMSO将结晶溶解，将酶标仪调整到490 nm 波长处，检测各孔的OD 值，用不添加细胞的孔调零以后，分析细胞存活率变化。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡

按照Control、OX-LDL、siRNA control+OX-LDL、NF-κB p65 siRNA+OX-LDL分组培养后，添加1×PBS 将各组内皮祖细胞洗涤2 次。再加入0.25%胰蛋白酶将细胞收集后，加入400 μl 缓冲液混合，分别添加Annexin V-FITC 约10 μl 和PI 约5 μl 至各组待测细胞中混合，避光反应15 min。继续加入100 μl 缓冲液，流式细胞仪检测分析细胞凋亡水平。

1.7 Western blotting 检测细胞中活化的Caspase-3、Caspase-9 蛋白水平

按 照Control、OX-LDL、siRNA control+OX-LDL、NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 分组培养后，检测细胞中活化的Caspase-3、Caspase-9蛋白表达情况，步骤同1.3部分中Western blotting 操作。

1.8 SOD 活力及MDA 含量检测

按 照Control、OX-LDL、siRNA control+OX-LDL、NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 分组培养后，收集细胞，把细胞裂解以后，检测裂解液中SOD 活力及MDA 含量，步骤均参照试剂盒说明书标准流程。

1.9 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OX-LDL 诱导内皮祖细胞中NF-κB p65 的表达的影响

内皮祖细胞经过OX-LDL 处理以后，细胞中的NF-κB p65 mRNA及蛋白水平均升高（P＜0.05）。OX-LDL 可以诱导内皮祖细胞中NF-κB p65 的表达。见表1 和图1。

表1 两组NF-κB p65 mRNA和蛋白表达的比较 （±s）

表1 两组NF-κB p65 mRNA和蛋白表达的比较 （±s）

注：†与Control 组比较，P＜0.05

组别 NF-κB p65 mRNA NF-κB p65 蛋白Control 组 1.000±0.113 0.170±0.022 OX-LDL 组 1.852±0.121† 0.302±0.053†t值 12.269 4.181P值 0.000 0.000

图1 OX-LDL 处理前后内皮祖细胞中NF-кB p65 表达

2.2 NF-κB p65 siRNA 对OX-LDL 条件下内皮祖细胞中NF-κB p65 表达的影响

内皮祖细胞感染NF-κB p65 siRNA 慢病毒，经过OX-LDL 处理以后，细胞中的NF-κB p65 mRNA及蛋白水平降低（P＜0.05）。见表2 和图2。

2.3 敲低NF-κB p65 对OX-LDL 条件下内皮祖细胞增殖活性的影响

OX-LDL 处理后内皮祖细胞存活率降低，细胞增殖能力下降（P＜0.05），敲低NF-κB p65 可以提高OX-LDL 条件下内皮祖细胞增殖活性。敲低NF-κB p65 具有拮抗OX-LDL 诱导的内皮祖细胞增殖抑制作用。见表3。

表2 各组NF-κB p65 mRNA 和蛋白表达的比较 （±s）

表2 各组NF-κB p65 mRNA 和蛋白表达的比较 （±s）

注：†与OX-LDL 组、siRNA control+OX-LDL 组比较，P＜0.05

NF-κB p65 蛋白OX-LDL 组 1.000±0.000 0.279±0.016 siRNA control+OX-LDL 组 1.011±0.082 0.294±0.042 NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 组 0.321±0.027† 0.110±0.031†F值 192.863 31.759P值 0.000 0.001组别 NF-κB p65 mRNA

图2 NF-κB p65 siRNA 对OX-LDL 条件下 内皮祖细胞中NF-κB p65 沉默效果

2.4 敲低NF-κB p65 对OX-LDL 条件下内皮祖细胞凋亡的影响

OX-LDL 处理后内皮祖细胞凋亡率升高，同时细胞中凋亡蛋白活化的Caspase-3、Caspase-9 水平也升高，敲低NF-кB p65 可以降低OX-LDL 条件下内皮祖细胞凋亡水平并下调细胞中活化的Caspase-3、Caspase-9蛋白水平（P＜0.05）。敲低NF-кB p65 具有拮抗OXLDL 诱导的内皮祖细胞凋亡作用。见图3、4 和表4。

表3 沉默NF-κB p65 后经OX-LDL 处理的 内皮祖细胞存活率 （%，±s）

表3 沉默NF-κB p65 后经OX-LDL 处理的 内皮祖细胞存活率 （%，±s）

注：1）与Control 组比较，P＜0.05；2）与OX-LDL 组、siRNA control+OX-LDL 组比较，P＜0.05

组别 存活率Control 组 100.000±9.021 OX-LDL 组 58.449±8.1371）siRNA control+OX-LDL 组 60.479±7.232 NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 组 81.359±8.6892）F组 23.709P组 0.000

2.5 敲低NF-κB p65 对OX-LDL 条件下内皮祖细胞氧化损伤的影响

OX-LDL 处理后内皮祖细胞裂解液中抗氧化酶SOD 活性降低，MDA 含量升高，敲低NF-κB p65 能够降低OX-LDL 条件下内皮祖细胞裂解液中MDA 含量，并提高SOD 活性（P＜0.05）。敲低NF-κB p65具有拮抗OX-LDL 诱导的内皮祖细胞氧化应激的作用。见表5。

图3 内皮祖细胞凋亡

图4 沉默NF-кB p65 后经OX-LDL 处理的内皮祖细胞凋亡变化

表4 沉默NF-кB p65 后经OX-LDL 处理的内皮祖细胞凋亡率及活化的Caspase-3、Caspase-9 蛋白水平变化 （±s）

表4 沉默NF-кB p65 后经OX-LDL 处理的内皮祖细胞凋亡率及活化的Caspase-3、Caspase-9 蛋白水平变化 （±s）

注：1）与Control 组比较，P＜0.05；2）与OX-LDL 组、siRNA control+OX-LDL 组比较，P＜0.05

组别 凋亡率/% 活化的Caspase-3 活化的Caspase-9 Control 组 8.561±1.522 0.237±0.043 0.281±0.052 OX-LDL 组 28.957±3.7431） 0.410±0.0591） 0.542±0.0811）siRNA control+OX-LDL 组 29.411±4.171 0.417±0.033 0.560±0.072 NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 组 15.782±1.1622） 0.320±0.0212） 0.393±0.0522）F值 36.044 13.215 12.877P值 0.000 0.002 0.002

表5 沉默NF-кB p65 后经OX-LDL 处理的内皮祖细胞裂解液中SOD 活性及MDA 含量变化 （±s）

表5 沉默NF-кB p65 后经OX-LDL 处理的内皮祖细胞裂解液中SOD 活性及MDA 含量变化 （±s）

注：1）与Control 组比较，P＜0.05；2）与OX-LDL 组、siRNA control+OX-LDL 组比较，P＜0.05

MDA 含量/（nmol/ml）组别 SOD 活性/（u/ml）Control 组 42.510±3.242 5.689±1.348 OX-LDL 组 9.892±1.1421） 14.581±1.7211）siRNA control+OX-LDL 组 10.210±1.262 14.821±1.958 NF-кB p65 siRNA+OX-LDL 组19.676±1.8722） 11.010±1.2312）F值 166.062 21.510P值 0.000 0.000

3 讨论

近年来很多研究表明，在骨髓、脐带血、外周血等中均有内皮祖细胞存在，内皮祖细胞作为血管内皮细胞的前体细胞，其以CD34、CD133、VEGFR-2 为标志，能够分化成为内皮细胞，在血管新生及损伤修复中具有重要作用[4]。动脉粥样硬化是以血管内皮损伤为主特征的心血管系统疾病，其发病机制与内皮祖细胞损伤密切相关[5]。OX-LDL 是动脉粥样硬化发生的主要诱导因子，也是内皮功能障碍发生的原因之一，其可以诱导内皮祖细胞损伤[6]。本研究表明，OX-LDL组处理后的内皮祖细胞增殖活性降低，细胞凋亡增多，提示成功构建动脉粥样硬化内皮祖细胞损伤模型。

NF-κB 在体内的分布极为广泛，是一个转录因子家族，NF-κB 含有5 个成员，其中NF-κB p65 是重要的NF-κB 家族成员之一，其N 端含有Rel 同源区，参与DNA 结合和二聚体的形成，另外，NF-κB p65 还含有1 个TAD 结构域，具有正向调控基因转录的作用[7]。NF-κB p65 参与多种生理过程，包括细胞生长、凋亡、免疫反应等，在内皮细胞、心肌细胞等各种类型的细胞中均有表达[8]。目前研究表明，NF-κB p65 在动脉粥样硬化中过度激活，参与内皮祖细胞损伤发生，在银杏内酯B、Ang-1基因调控内皮祖细胞增殖中异常表达[9]。本实验表明，OX-LDL 处理可以诱导内皮祖细胞中NF-κB p65 高表达，敲低其表达后可以减少OX-LDL 诱导的内皮祖细胞凋亡，提高内皮祖细胞增殖活性，提示敲低NF-κB p65 在动脉粥样硬化内皮祖细胞损伤中发挥保护作用。

众所周知，正常组织中细胞增殖和凋亡处于动态平衡状态，当细胞过度增殖或者过度凋亡时都可以引起疾病的发生，内皮祖细胞过度凋亡是动脉粥样硬化发生的重要机制之一[10]。细胞凋亡的发生与细胞内的Caspase 蛋白级联反应有关，该级联反应几乎参与所有细胞的凋亡过程，Caspase-9 是位于凋亡反应上游的起始因子，Caspase-3 位于凋亡反应的下游，两者在活化后可以促进细胞凋亡的发生。氧化应激是细胞凋亡发生的诱导因素之一，细胞内过量的氧自由基可以促进细胞膜上的脂质发生过氧化，而细胞内过量的氧自由基与细胞内抗氧化酶SOD 活性降低有关，MDA是脂质发生过氧化的产物[11]。另外，内皮祖细胞氧化损伤也是动脉粥样硬化发生的机制之一。NF-кBp65具有促进心肌细胞、血管内皮细胞等多种细胞凋亡作用，在心血管系统疾病中发挥促进作用[12]。本实验的研究结果显示，OX-LDL 条件下，敲低NF-κB p65 后的内皮祖细胞中Caspase-3、Caspase-9 蛋白水平降低，SOD 活性升高，MDA 含量降低，这可能表明敲低NFκB p65 通过降低OX-LDL 诱导的内皮祖细胞氧化应激减少细胞凋亡。

NF-κB p65 在内皮祖细胞损伤中表达水平升高，敲低其表达可以减少内皮祖细胞氧化应激和细胞凋亡，提高内皮祖细胞增殖活性，敲低NF-κB p65 表达具有减轻动脉粥样硬化内皮祖细胞损伤作用，这为研究动脉粥样硬化的发生机制提供了基础，也为以后探讨NF-κB p65 在内皮祖细胞损伤中的作用机制奠定了基础，但对其具体的调控机制和作用机制尚不清楚，在以后的研究中将进一步探讨。