高效液相色谱法测定调味油中罗丹明B

王丽君 朱书强 周佳

摘要 [目的]建立一种简单、快捷测定调味油中工业染料罗丹明B的方法。[方法]样品经甲醇超声提取，高速离心，上清液经0.22 μm膜过滤后进高效液相色谱C18柱分离，荧光检测器检测。[结果]罗丹明B在5～500 ng/mL范围内线性关系良好（相关系数R2为0.999 9），检出限为5 μg/kg，回收率为89.2%～93.5%，相对标准偏差为1.7%（n=6）。[结论]该法操作简便、准确、重现性好，可用于调味油中非法添加物罗丹明B含量的测定。

关键词 罗丹明B;调味油;高效液相色谱;C18柱;荧光检测

中图分类号 TS 207.5  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）12-0210-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.12.058

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Abstract [Objective] The study established a simple and quick determination method of the industrial dye rhodamine B in flavoring oil. [Method] The sample was extracted with methanol ultrasonic and high speed centrifugation. The upper cleaning liquid was filtered by 0.22 μm membrane and then separated by high performance liquid chromatography C18 column， and the fluorescence detector was detected. [Result] The results showed that rhodamine B had good relationship between 5-500 ng/mL （correlation coefficient R2=0.999 9）， and the detection limit was 5 μg/kg， and the recovery rate was 89.2%-93.5%. The relative standard deviation was 1.7%（n=6）. [Conclusion] The method is simple， accurate and reproducible， and can be used for the determination of the content of illegally added rhodamine B in flavoring oil.

Key words Rhodamine B;Seasoning oil;HPLC;C18 column;Fluorescence detection

羅丹明B（Rhodamine B）又称玫瑰红B或碱性玫瑰精，俗称花粉红，是一种具有鲜桃红色的人工合成染料，易溶于水、乙醇[1]。罗丹明B具有价格低廉、色泽红艳、稳定性强等特点，常用作增加颜色的食品添加剂，但后来试验证明罗丹明B会致癌，已被禁止用作食品染色[2-5]。经市场走访调查，一些商贩为了节约成本，低价收购一些劣质的辣椒、花椒、芥末等原料加工成花椒油、辣椒油、芥末油，为了改变产品的卖相，往往添加罗丹明B来提高其红艳度，以次充好欺骗消费者。罗丹明B的检测常用中性氧化铝固相萃取小柱进行前处理净化，但要控制中性氧化铝小柱的活性，操作步骤比较繁琐，回收率也无法保证。当前检测食品中罗丹明B的方法只有SN2430—2010，该方法需要过凝胶固相色谱，前处理消耗有机溶剂量比较大，分析时间长，试验成本高，不能被广泛应用。笔者对调味油中的罗丹明B采用纯甲醇提取，高效液相色谱分离，荧光检测器检测，方法简便，特异性和回收率高，适合调味油的定量分析[6-12]。

1 材料与方法

1.1 材料

供试样品为市售辣椒油、芥末油、花椒油等。试剂：甲醇，色谱纯，纯度>99.99%，赛默飞世尔科技有限公司;罗丹明B标准品，纯度≥99.0%，德国Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 仪器与设备

Waters e2695高效液相色谱仪配2475荧光检测器，美国沃特世公司;湘仪1200型离心机，德国BECKMAN COULTER公司;电子天平，感量为0.1 g和0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多仪器（中国）有限公司;YQ-1002C型超声波清洗器，上海易净超声波仪器有限公司;MT/VORTEX型旋涡混匀器，上海五相仪器仪表有限公司;容量瓶：规格10、25 mL等，泰州市和顺玻璃制品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理方法。称取2.0 g样品（精确至0.01 g）于25 mL容量瓶中，加入20 mL甲醇，超声提取15 min后，用甲醇定容。高速离心5 min，取上清液过 0.22 μm 微孔滤膜后经高效液相色谱分析。

1.3.2 色谱条件。色谱柱：C18柱4.6 mm×250 mm，5 μm;流动相：甲醇+水（70∶30，V/V）;流速：1.0 mL/min;柱温：35 ℃;进样量：10 μL;激发波长（Ex）550 nm，发射波长（Em）580 nm[13]。

1.3.3 罗丹明B标准溶液的配制。罗丹明B标准储备液：准确称取10.0 mg罗丹明B标准品至100 mL的容量瓶中，用甲醇配制成浓度为100 μg/mL的标准储备液，0～4 ℃避光保存。标准工作溶液：用甲醇稀释成5.0、10.0、20.0、50.0、500.0 ng/mL备用。

2 结果与分析

2.1 不同提取溶剂对样品检测的影响

文献[14-20]报道，调味品大多采用乙酸乙酯和环己烷提取。笔者采取水、甲醇、乙腈、乙酸乙酯-环己烷（体积比1∶1）作为提取溶剂，在辣椒油中分别加入0.5、1.0、4.0 mL 50 ng/mL 的罗丹明B标准溶液，按照“1.3.1”的方法进行提取并测定其含量，计算回收率。由表1可知，當采用甲醇作为提取溶剂时，回收率最高。因此，该试验采用甲醇作为提取溶剂。

2.2 流动相及检测波长的选择

比较了水-甲醇及水和乙腈体系不同配比对罗丹明B测定的影响，结果表明，当采用甲醇-水（30∶70，V/V）作为流动相时，罗丹明B峰形尖锐，不拖尾（图1），且流动相配比简单，方便快捷。根据《进出口食品中罗丹明B的检测方法》确定了罗丹明B的激发波长Ex=550 nm，发射波长Em=580 nm。

2.3 标准曲线的建立

采用上述优化的色谱条件对罗丹明B标准工作液进行分析检测，以罗丹明B标准工作液质量浓度（x）为横坐标，色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，罗丹明B的线性回归方程为y=32.467 x+0.096，相关系数（R2）为0.999 9，检出限为5 μg/kg，RSD为1.7%。

罗丹明B在5～500 ng/mL浓度范围内与峰面积线性关系良好。说明该方法线性范围宽，适合不同浓度样品的分析。按3倍的信噪比计算得出，该方法的检出限为5.0 μg/kg。

2.4 精密度试验

取10 ng/mL 罗丹明B标准品，按上述优化的方法平行测定6次，结果分别为9.73、9.68、9.66、9.98、9.80、9.77 ng/mL，RSD为1.7%。

罗丹明B标准品的RSD<3%，符合方法验证精密度要求。

2.5 回收率及重现性试验

将空白辣椒油、花椒油、芥末油按照上述的方法处理后，分别添加一定量的标准溶液，添加浓度为0.2、0.5、2.0 mg/kg，每个样同一浓度做6个平行样，结果见表2～4。由表2～4可见，该方法具有较高的准确度和可靠性。

2.6 实际样品的测定

按照上述方法对在本地区购买的150批次的辣椒油、芥末油、花椒油进行提取，并采用高效液相色谱-荧光法测定，均未发现阳性样品。

3 结论

建立了一种快速、简便的测定调味油中罗丹明B的方法。样品经纯甲醇超声提取后，高速涡旋、离心，有机膜过滤，用高效液相色谱C18柱分离，荧光检测器检测。实际测定结果表明，该方法前处理步骤简单，提取率高，重现性好，适用于调味油中罗丹明B的定量分析。

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