兴安杜鹃基本培养基和外殖体选择的初步研究

杜凤国 吕伟伟 王欢

摘要 [目的]研究兴安杜鹃苗木快繁技术，为兴安杜鹃大规模园林绿化应用提供技术保障。[方法]以兴安杜鹃的叶芽、花芽、叶片、茎尖、茎段为外植体，以MS、WPM、Read、B5为培养基，采用不同采集时间、不同消毒方法，通过接种、培养、观察和对比分析，对兴安杜鹃的快速繁殖进行研究。[结果]兴安杜鹃组织培养最佳基本培养基为WPM培养基;最佳外植体为1.5～2.0 cm茎尖和茎段;最佳灭菌方法为70%乙醇30 s结合0.1% HgCl2 10 min;最佳取材时间为3月中旬至5月中旬。[结论]该研究可为绿化苗木生产、城镇绿化及乡村振兴生态宜居目标的实现提供支撑。

关键词 兴安杜鹃;组织培养;快速繁殖

中图分类号 S 685.21  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）12-0136-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.12.037

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract [Objective]To study the rapid propagation technology of Rhododendron dauricum seedlings， and provide technical support for the largescale landscaping application of Rhododendron dauricum.[Method]The leaf buds， flower buds， leaves， stem tips and stem segments of Xing'an Rhododendron were used as explants， and MS， WPM， Read B5 were used as the medium.The rapid propagation of Rhododendron dauricum  studied by using explants with different sampling time and disinfection methods through inoculation， culture， observation and comparative analysis.[Result]The best basic medium for tissue culture of Rhododendron dauricum was WPM;the optimal explants was 1.5-2.0 cm long stem tips and stem segments;the best sterilization method on the surface of explants was 70% alcohol 30 s and then combined with 0.1% HgCl2 10 min;the best season for sampling time was from midMarch to midMay.[Conclusion]This research can provide technique to reproduction of greening seedlings，urban greening and realization of ecological livable target  in rural vitalization.

Key words Rhododendron dauricum;Tissue culture;Rapid propagation

兴安杜鹃（Rhododendron dauricum L.）又名金达莱、满山红、达子香、映山红等，属于杜鹃花科（Ericaceae）杜鹃花属（Rhododendron）的落叶或常绿灌木，主要分布于东北地区的大小兴安岭和长白山林区，多生于山脊处的石砬子、陡壁、荒山、干山坡，耐寒冷、干旱和瘠薄。先花后叶，其花紫红色，十分美丽，香味浓郁。叶和花的提取物具有镇定、利尿、抗肿瘤的作用，是一种集观赏、药用和芳香于一体的经济价值很高的野生木本花卉，极具开发价值。目前一些学者对兴安杜鹃种子及苗木生长特性[1]、生理特性[2]、叶化学成分[3-4]、精油化學成分[5]、药用价值[6]、种子与扦插繁殖[7-8]等进行了研究;还有学者对同属的其他种如：杜鹃[9]、西洋杜鹃[10]等组织技术进行了研究。对于兴安杜鹃组培技术，虽有学者进行了研究并取得进展，但污染率和褐化率严重，只形成部分愈伤组织[11]。随着城市林业和乡村振兴生态宜居建设的深入推进，兴安杜鹃正以它独特的先花后叶观赏特性，日益越受到人们的青睐。人们直接

从森林中挖掘野生的兴安杜鹃植株栽植在一些城市公园、广场、道路等园林绿地上，不仅成本高，而且严重破坏了森林生态环境。为加快兴安杜鹃在城乡绿化上的应用，必须解决快繁大量优质苗木问题，而组织培养是保持原种优良特性、不受季节限制的一种快繁苗木技术。为此，笔者从基本培养基和外植体选择等方面研究兴安杜鹃苗木组织培养技术，以期为绿化苗木生产、城镇绿化及乡村振兴生态宜居目标的实现提供技术支撑。

1 材料与方法

2017年3月中旬，从吉林市雷达山上采集兴安杜鹃的休眠枝条，在温室中进行水培，以其萌发的芽作为试验材料。5月中旬，采集兴安杜鹃幼嫩枝条，放于水中进行室内培养，接种时以其幼嫩叶片、茎尖及茎段为外植体。后于7月中旬采集兴安杜鹃嫩枝，进行培养。

1.1 材料灭菌

（1）花芽、叶芽的消毒方法。将采下的萌发芽用毛刷刷去表面的浮尘，用洗涤剂轻微刷洗，在自来水中冲洗1 h，可把杂菌洗掉约60%。然后采用3组消毒方法：70%的乙醇中浸泡30 s，再结合0.1%的HgCl2分别消毒6、10、15 min;0.1% HgCl2单独使用，分别消毒6、10、15 min;70%乙醇30 s。消毒过程中要用玻璃棒不停搅拌，在超净工作台上，剥去外层芽鳞，露出内芽，再用无菌水冲洗3～5次。

（2）叶片、茎尖及茎段消毒方法的选择及接种。用清水将外植体表面冲洗干净，用70%的乙醇灭菌30 s，然后用0.1%的HgCl2消毒10 min后，在超净工作台上用无菌水冲洗3～5次。

1.2 基本培养基的筛选 试验选用2.0 mg/L ZT+0.5  mg/L IBA的激素配比，比较MS、WPM、Read和B5 4种培养基对兴安杜鹃快速繁殖的影响。

1.3 最佳外植体的选择 分别采用花芽、叶芽、叶片、茎尖及茎段5种外植体，研究不同外植体对再生植株的影响，从而筛选出最佳外植体。

1.4 培养条件 培养室温度（23±1）℃，光照时间为12～14 h/d，光照强度约2 000 Lx。

2 结果与分析

2.1 最佳培养基的筛选 将外植体消毒处理后，分别接种到4种培养基上，附加2.0 mg/L ZT+0.5  mg/L IBA，随机选取叶芽、花芽、茎段、茎尖为外植体进行试验，观察外植体反应情况。30 d 后统计污染率、芽分化率，计算增殖倍数，结果见表1。

由表1可见，MS培养基上外植体几乎全部褐化死亡，偶有存活的，几乎不形成愈伤组织，形成的嫩枝短小细弱，叶片卷曲，长势很差。WPM培养基上外植体增殖系数最高，腋芽生长健壮，且腋芽又生腋芽，形成一丛灌木状小枝，小枝节间较长，叶片比较平展，有利于光合作用，从而为自身提供更多的养分，生长状况良好;从产生愈伤组织来看，WPM培养基上的愈伤组织直径较大，愈伤组织黄绿色，致密，生长快，发育良好。Read培养基上外植体腋芽长势较好，但增殖系数不高，产生的愈伤组织黄白色，疏松，长势一般，分化少，生长慢。B5培养基上外植体腋芽长势一般，愈伤组织白色疏松，直径约1.2 cm，增殖倍数较高，但发育不正常。

观察比较发现，无论是从不定芽的分化发育情况，还是从愈伤组织的长势来看，兴安杜鹃都在WPM培养基中生长状况较好。因此，笔者选择WPM作为兴安杜鹃快速繁殖的基本培养基。

2.2 消毒方法的选择 在查阅文献的基础上[3-6]，该试验选用70%乙醇，消毒30 s，结合不同时间的0.1%HgCl2消毒进行对比，从而选出有效的消毒方法，将外植体接种到WPM+ZT 2.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L的培养基上，统计染菌率和存活率。由于消毒剂会对植物体产生伤害，因此，需要统计污染率、死亡率和存活率，结果见表2。

由表2可看出，将外植体用70%乙醇消毒30 s后再用0.1% HgCl2消毒10 min的消毒效果最好，存活率可以达到88%。表面消毒剂的使用要求既要杀死材料表面的微生物，又不至于损伤材料组织，影响生长。70%乙醇有更强的穿透力和杀菌力，在其中浸润30 s，具有浸润和灭菌的双重作用，但它也能杀死外植体细胞、组织，会把材料损坏，导致死亡，用70%乙醇消毒的存活率最高也只有28%。消毒时间长短对外植体的存活和污染有很大影响，时间越长，染菌率下降越明显，如0.1% HgCl2 15 min的污染率（5%）比0.1% HgCl2 6 min的污染率（40%）要低，说明消毒效果要好，可是存活率也随之下降。考虑外植体的存活及消毒剂作用时间长短的影响程度，试验确定外植体的最适方法为70%乙醇消毒30 s+0.1% HgCl2消毒10 min，此时外植体的存活率高，污染率也较低。

2.3 最佳外植体的选择 试验选择了水培枝条的花芽和叶芽，野外枝条的茎尖、茎段及叶片作为外植体。花芽和叶芽剥去芽鳞，茎尖、茎段剪成1.5～2.0 cm，叶片剪成0.5 cm×0.5 cm的方块接种在基本培养基中，附加ZT 2.0  mg/L+IBA 0.5  mg/L，30 d后观察外植体生长分化状况，结果见表3。

表3表明，从愈伤组织形成来看，茎尖、茎段、叶片均有愈伤组织形成，但是叶片的愈伤组织形成率较低，只有50%，并且叶片的污染率也较高，所以从愈伤组织途径进行诱导可以选择茎尖、茎段;从丛生芽的分化上，叶芽的丛生芽分化率为66.66%，增殖系数为2.2倍，而茎尖的丛生芽分化率为83.33%，茎段的丛生芽分化率为83.72%，而且丛生芽的增殖系数较高（達到了3.6～4.0倍），丛生芽生长健壮，生长状况良好，所以选用1.5～2.0 cm的茎尖和茎段作为外植体。

2.4 最佳取材时期 为了确定最佳取材季节，笔者分别在3月中旬、5月中旬、7月中旬进行了3次取材，接种在基本培养基2.0 mg/L ZT+0.5  mg/L IBA上，统计污染率、褐化率以及分化率，结果见表4。

由表4可看出，3月中旬与5月中旬取材的外植体污染率比较低，褐化率都为0，分化率分别达到84.09%和83.33%;而7月中旬取材的兴安杜鹃已经半木质化，污染率和褐化程度都比较严重，分化率仅33.33%。因此，可以在3月中旬至5月中旬。

3 结论

该试验得出以下结论：

（1）最佳培养基为WPM培养基。从诱导愈伤组织产生、芽分化和增殖系数综合考虑，最佳培养基为WPM培养基，但要确定生根阶段的最佳培养基，还需要通过进一步的试验确定。

（2）最佳消毒方法为70%乙醇消毒30 s，而后用0.1% HgCl2消毒10 min。但在选择消毒剂时，既要考虑其消毒杀菌的能力，还要考虑是否易于被蒸馏水冲洗或可自行挥发。该试验选用的HgCl2 较难去掉。因此，要充分地冲洗，以达到零残留。

（3）最佳外植体为1.5～2.0 cm的茎尖和茎段。在快繁时，外植体不能过大，过大消毒不彻底，易于污染，过小组培不易成活。同时，茎尖是树木的生长点，在来源上往往受到限制。因此，实际生产中可以将茎尖与茎段相结合进行应用。

（4）最佳取材时期为3月中旬至5月中旬。取材过早枝条处于休眠状态，外植体对于诱导反应迟钝或无反应，取材过晚外植体在组织培养中易褐化。因此，取材时间以芽萌动和生长季节早期为宜。

参考文献

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