结直肠癌组织lncRNA CRNDE、miR-181a表达变化及其与患者临床病理特征的关系

余蕙君，刘青，崔胜金，曹朝鹏，周义文

(南方医科大学深圳医院,广东深圳518110)

结直肠癌是我国常见的消化系统恶性肿瘤之一，近年来随着人民饮食结构和饮食习惯改变以及人口老龄化加剧，其发病率呈逐年上升趋势[1，2]。目前，结直肠癌的治疗已取得了巨大进步，如微创手术普及、新型化疗药物和分子靶向药物临床应用，明显提高了治疗效果[3]。但对于中晚期结直肠癌患者，失去了手术根治的机会，内科治疗效果亦不理想，患者预后往往较差。因此，有必要深入研究结直肠癌发生、发展的分子机制，寻找更可靠的肿瘤标志物用于疾病筛查以及指导临床治疗[4]。随着RNA检测技术的发展，在肿瘤组织中发现了多种非编码RNA(ncRNA)异常表达，并参与肿瘤的发生、发展。微小RNA(miRNA)是一类内源性非编码小分子RNA，长度为18～25个核苷酸，通过结合mRNA的3′非编码区，改变mRNA的稳定性，影响靶基因表达，不仅可参与正常细胞的增殖、分化、凋亡等调控过程，还可参与肿瘤细胞的恶性增殖、浸润和迁移等[5]。miR-181a是miRNA家族成员之一，属于miR-181家族，定位于人5号染色体上。有研究发现，miR-181a可调节下游抑癌基因PTEN表达，影响下游细胞信号传导，从而促进结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移等[6]。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸、具有多种调控功能的RNA分子，可作为分子海绵结合miRNA或染色质修饰因子，调节靶基因表达。lncRNA结直肠肿瘤差异表达基因(CRNDE)是结直肠肿瘤差异表达基因的表达产物，定位于人16号染色体上，可在多种恶性肿瘤组织中异常表达[7]。本研究观察了结直肠癌组织lncRNA CRNDE、miR-181a表达变化，并探讨二者在结直肠癌发生、发展中的作用。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年4月～2018年10月南方医科大学深圳医院收治的结直肠癌患者91例。所有患者经术后组织病理检查明确诊断。纳入标准：①符合结直肠癌诊断，病理类型为腺癌；②初诊，年龄24～78岁；③行结直肠癌切除手术，术前未接受任何抗肿瘤治疗；④Karnofsky评分≥60分，预计生存期≥3个月；⑤临床病理资料完整。排除标准：①合并结直肠其他疾病、其他部位恶性肿瘤以及心、肝、肺、肾等重要脏器严重疾病者；②术前已接受任何抗肿瘤治疗者；③临床病理资料不完整者。其中，男56例、女35例，年龄(54.1±8.7)岁；肿瘤类型：结肠癌52例，直肠癌39例；肿瘤直径：<5 cm 41例，≥5 cm 50例；临床分期：Ⅰ、Ⅱ期44例，Ⅲ、Ⅳ期47例；组织分化程度：高中分化61例，低分化30例；有淋巴结转移19例，无淋巴结转移72例。本研究经南方医科大学深圳医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

1.2 lncRNA CRNDE、miR-181a表达检测 采用RT-qPCR法。将手术切除的结直肠癌组织及其配对的癌旁正常组织(距肿瘤组织边缘≥5 cm)置于液氮中速冻，-80 ℃冰箱保存备用。实验前取冻存组织20～30 mg，液氮下研磨成粉末，采用TRIzol法提取组织总RNA，经紫外分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0，可用于后续实验。按反转录试剂盒说明将总RNA逆转录为cDNA，逆转录反应条件：16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min。以cDNA为模板，按RT-qPCR试剂盒说明进行PCR扩增。所有引物序列由深圳华大基因股份有限公司设计合成。lncRNA CRNDE上游引物5′-GCGGAGGAGAGGTGTTAAGTGT-3′，下游引物5′-AACAGGTTTTACCTCCTTATCTTCAGAA-3′；内参GAPDH上游引物5′-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′，下游引物5′-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′。miR-181a上游引物5′-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3′，下游引物5′-UUGUACUACACAAAAGUCUG-3′；内参U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物3′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-5′。lncRNA CRNDE PCR反应体系共20 μL：cDNA模板2 μL，上下游引物各0.8 μL，2×SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL，50×ROX Dye 0.4 μL，无菌水6 μL；反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s、54 ℃ 35 s、72 ℃ 30 s共40个循环。miR-181a PCR反应体系共40 μL：cDNA模板2.6 μL，上下游引物各0.8 μL，TaqMan Universal PCR Master MixⅡ 20 μL，small RNA Assay 2 μL，无菌水补足至40 μL；反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min共40个循环。所有反应在ABI 7900型实时荧光定量PCR仪上完成。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 结直肠癌组织与癌旁正常组织lncRNA CRNDE、miR-181a表达比较 结直肠癌组织与癌旁正常组织lncRNA CRNDE相对表达量分别为0.896±0.120、0.124±0.057，miR-181a相对表达量分别为0.326±0.072、2.307±0.259。结直肠癌组织lncRNA CRNDE相对表达量明显高于癌旁正常组织，miR-181a相对表达量明显低于癌旁正常组织(t分别为55.434、70.298，P均<0.05)。

2.2 结直肠癌组织lncRNA CRNDE、miR-181a表达与患者临床病理特征的关系 结直肠癌组织lncRNA CRNDE、miR-181a表达与肿瘤临床分期、组织分化程度有关(P均<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤类型、肿瘤直径和淋巴结转移无关(P均>0.05)。见表1。

表1 结直肠癌组织lncRNA CRNDE、miR-181a表达与患者临床病理特征的关系

2.3 结直肠癌组织lncRNA CRNDE表达与miR-181a表达的关系 结直肠癌组织lncRNA CRNDE相对表达量与miR-181a相对表达量呈明显负相关关系(r=-0.632，P<0.05)。见图1。

图1 结直肠癌组织lncRNA CRNDE表达与miR-181a表达的关系

3 讨论

结直肠癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤，每年导致近70万人死亡，是世界上仅次于肺癌、肝癌和胃癌的第四大致命癌症。近年来随着人民饮食结构和饮食习惯改变以及人口老龄化加剧，其发病率呈逐年上升趋势[8]。结直肠癌的病因与遗传因素、环境因素、饮食习惯等有关，但其确切发病机制尚不清楚。目前认为，结直肠癌的发生、发展是一个多因素、多步骤参与的复杂过程[9]。因此，深入研究结直肠癌发生、发展的分子机制，对疾病早期筛查和指导临床治疗具有重要意义。

近年随着RNA检测技术的发展，在肿瘤组织中发现了多种ncRNA异常表达，并参与肿瘤的发生、发展。有研究发现，ncRNA通过调控靶基因参与相关信号转导通路，继而影响肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移及血管生成等过程[10]。基于核苷酸长度，可将ncRNA分为短ncRNA(<200 nt)和长ncRNA(>200 nt)。miRNA是一类短ncRNA，可通过直接抑制mRNA翻译或通过结合其3′非翻译区降解mRNA分子，在转录后水平调控靶基因表达，从而参与细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程。miR-181a是miRNA家族成员之一，属于miR-181家族，定位于人5号染色体上。miR-181a在乳腺癌、非小细胞肺癌、胶质瘤等组织中异常表达，可通过影响STAT3、MET等基因表达，参与肿瘤的恶性进展[11～13]。在结肠癌细胞中，miR-181a能够通过影响PRKCD基因表达，发挥调控肿瘤细胞生长作用[14]。lncRNA是一类长ncRNA，可作为分子海绵结合miRNA，参与神经元的分化发育、配子形成及肿瘤进展等过程。lncRNA CRNDE是结直肠肿瘤差异表达基因的表达产物，定位于人16号染色体，与IRX5基因相邻，可与IRX5共享双向启动子。lncRNA CRNDE具有组织特异性和时间特异性表达模式，在人体正常组织中几乎不表达，但在肿瘤组织中表达明显升高，有可能成为肿瘤早期诊断的指标和潜在的治疗靶点。但目前关于结直肠癌组织lncRNA CRNDE、miR-181a表达变化及二者表达关系的报道较少。

本研究结果发现，结直肠癌组织miR-181a相对表达量明显低于癌旁正常组织，与以往报道[6]基本一致。其具体原因尚不清楚，可能与miR-181a的杂合性缺失有关，也可能与miR-181a表观遗传学修饰后导致其功能失活有关。本研究结果还发现，结直肠癌组织miR-181a表达与肿瘤临床分期、组织分化程度有关，而与患者性别、年龄、肿瘤类型、肿瘤直径和淋巴结转移无关。表明miR-181a可参与结直肠癌的恶性进展。本研究结直肠癌组织lncRNA CRNDE相对表达量明显高于癌旁正常组织。其具体原因亦不清楚，可能是抑制lncRNA CRNDE表达的miRNA，如miR-384表达下调，导致lncRNA CRNDE mRNA稳定性增加，进而引起lncRNA CRNDE转录后表达上调[15]。本研究结果还显示，结直肠癌组织lncRNA CRNDE表达与肿瘤临床分期、组织分化程度有关。表明lncRNA CRNDE亦参与结直肠癌的恶性进展。

有研究发现，lncRNA CCAT1可作为分子海绵结合miR-181a，进而影响下游靶基因HOXA1表达，从而促进肿瘤细胞增殖和迁移[16]；高度保守的异质核糖核蛋白U样蛋白2能够增加lncRNA CRNDE的稳定性，并通过活化Ras/MAPK信号通路，促进肿瘤细胞增殖和迁移[17]。但结直肠癌组织lncRNA CRNDE表达与miR-181a表达的关系尚不清楚。本研究结果发现，结直肠癌组织lncRNA CRNDE表达与miR-181a表达呈明显负相关关系。其机制可能是lncRNA CRNDE表达升高后，其结合miR-181a明显增多，从而使miR-181a的肿瘤抑制功能受到抑制，结直肠癌细胞增殖和迁移能力明显增强；而当敲除lncRNA CRNDE表达后，miR-181a表达明显升高，其对肿瘤的促进作用得到逆转。

综上所述，结直肠癌组织miR-181a低表达、lncRNA CRNDE高表达，二者共同参与结直肠癌的恶性进展，有望成为结直肠癌早期诊断的指标和潜在的治疗靶点。