血管紧张素原基因M235T位点多态性与重度子痫前期的关系

左金玲，栾青春，姜海英，李静，崔春柳

(1 唐山市妇幼保健院，河北唐山063000；2 唐山弘慈医院)

重度子痫前期是妊娠期高血压疾病中较为常见的一种类型，是导致孕产妇和围生儿死亡的重要原因之一[1]。重度子痫前期的基本病理生理变化是全身小动脉痉挛，临床表现为孕妇高血压、水肿、蛋白尿，胎儿生长受限、羊水过少和胎儿宫内窘迫等，妊娠晚期甚至出现抽搐、昏迷等紧急情况，同时可并发肾功能衰竭、心力衰竭、肺水肿等。近年越来越多研究表明，重度子痫前期一系列病理生理变化可能是由机体内在多个因素影响不同的易感基因或影响同一易感基因的多个相关位点以及与后天环境因素共同作用的结果[2]。肾素-血管紧张素系统(RAS)是一种激素内分泌系统，通过自分泌和旁分泌两种方式来维持血压和体内水、电解质平衡。血管紧张素原(AGT)是RAS的重要活性成分之一。近年国内外研究发现，AGT基因M235T位点基因突变可使血液循环中AGT活性升高，该位点基因多态性与高加索人和亚洲人先兆子痫的易感性有关，并可增加冠心病、心肌梗死等疾病的发生风险，但该位点基因多态性与重度子痫前期的关系仍存在争议[3～6]。为此，本研究探讨了AGT基因M235T位点多态性与重度子痫前期的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2010年11月～2011年7月在唐山市妇幼保健院住院并择期行剖宫产的重度子痫前期孕妇133例(观察组)，均符合《妇产科学》(第9版)重度子痫前期的诊断标准[7]。孕妇年龄(28.62±3.38)岁，BMI(30.65±3.63)kg/m2，SBP(163.19±11.53)mmHg，DBP(99.98±10.40)mmHg，孕周(36.17±2.57)周。选择同期在唐山市妇幼保健院住院但无指征剖宫产的正常孕妇93例(对照组)，年龄(28.05±2.97)岁，BMI(28.33±3.77)kg/m2，SBP(120.28±9.89)mmHg，DBP(75.41±8.19)mmHg，孕周(36.77±2.78)周。两组均为唐山市常住汉族人，单胎妊娠，无血缘关系，无异族通婚家族史。排除合并心脏病、糖尿病、肾病等内科疾病者，慢性高血压合并妊娠、慢性高血压合并子痫前期等其他产科并发症者，以及有吸烟、酗酒、药物滥用或精神性疾病史者。两组年龄、孕周比较P均>0.05，BMI、SBP、DBP比较P均<0.05。本研究经唐山市妇幼保健院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

1.2 AGT基因M235T位点多态性检测 ①DNA提取：采集所有孕妇术日清晨无宫缩状态下外周静脉血3 mL，EDTA抗凝，低渗法分离白细胞，氯仿/异戊醇法提取DNA，并置于EP管中，-80 ℃保存。②PCR扩增：参照Russ等[8]的研究设计引物序列，并由上海生工生物工程股份有限公司合成。AGT基因M235T位点上游引物5′-CGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTC-3′，下游引物5′-AGGGTGCTGTCCACACTGGACCC-3′(AC为非配对碱基，AGT基因第2外显子704位点突变为C，产生一个适合的酶切“半位点”，与之对应的另一个“半位点”是通过两个非配对碱基的引入来完成，这两个非配对碱基并不影响引物延伸)。以提取的DNA为模板，采用9700型PCR扩增仪(GeneAmp PCR system 9700)进行扩增。PCR反应体系共25 μL：无菌去离子双蒸水8.5 μL，2×Taq Master Mix(含Taq DNA Polymerase、2×Taq PCR Buffer、3 mmol/L MgCl2、400 μmol/L dNTP Mix) 12.5 μL，引物2 μL，模板DNA 2 μL；反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s、60 ℃退火40 s、72 ℃延伸60 s共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。③PCR产物酶切：取PCR扩增产物10 μL，加入限制性片段长度多态性酶切反应体系(无菌去离子双蒸水6 μL、10×Buffer B 2 μL、10 U/μL限制性内切酶Tth111 Ⅰ 2 μL)，37 ℃水浴过夜。次日，酶切产物在2.5%琼脂糖凝胶电泳下分离，紫外灯下观察。结果判定：PCR产物经限制性内切酶Tth111 Ⅰ消化，若两个等位基因均含内切酶识别位点，即为TT型(突变型)，酶切后产生140、23 bp两个片段，电泳后可见一个140 bp片段，由于23 bp片段过小，电泳后不显示；若两个等位基因中只含有一个内切酶识别位点，即为MT型(杂合子型)，酶切后产生163、140、23 bp三个片段，电泳后可见163、140 bp两个片段；若两个等位基因中不含内切酶识别位点则不被酶切，即为MM型(野生型)，电泳后可见一个163 bp片段。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验。采用比值比(OR)评价可能致病因素的影响，并计算其95%可信区间(95%CI)。样本代表性分析采用Hardy-Weinberg遗传平衡检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组AGT基因M235T位点基因型和等位基因分布比较 两组AGT基因M235T位点基因型和等位基因分布比较差异均有统计学意义(χ2分别为6.219、5.461，P均<0.05)。见表1。两组在校正高血压史这一混杂因素后，MT基因型者罹患重度子痫前期的危险性是MM基因型者的2.284倍(校正OR=2.284，95%CI：1.169～4.461，P<0.05)；TT基因型者罹患重度子痫前期的危险性是MM基因型者的3.910倍(校正OR=3.910，95%CI：1.532～9.982，P<0.01)。观察组AGT基因M235T位点TT基因型频率明显高于对照组，T等位基因频率亦明显高于对照组(P均<0.05)。

2.2 两组群体代表性分析 根据Hardy-Weinberg遗传平衡定律，观察组MM、MT、TT基因型理论值分

表1 两组AGT基因M235T位点基因型和等位基因分布情况

别为32.7、66.5、33.8，实际值分别为29、74、30；对照组MM、MT、TT基因型理论值分别为34.4、44.3、14.3，实际值分别为31、51、11。两组MM、MT、TT基因型理论值与实际值比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，说明研究对象具有群体代表性。

3 讨论

重度子痫前期是以孕期高血压、水肿、蛋白尿为主要临床表现，以胎盘浅着床为主要病理表现的妊娠期高血压疾病，一旦发生，对孕妇和胎儿的危害都是巨大的，甚至可能危及母儿生命。重度子痫前期的基本病理生理变化是全身小动脉痉挛，妊娠晚期可出现抽搐、昏迷等紧急情况，同时可并发肾功能衰竭、心力衰竭、肺水肿等。重度子痫前期的发病机制仍不十分清楚，目前已形成多种学说，如血管内皮损伤学说、免疫学说、胎盘缺血学说等，均可在某一方面阐释其发病机制。近年随着分子生物医学发展，越来越多与重度子痫前期相关的基因被定位、克隆，这为探索重度子痫前期发病的分子机制提供了新思路。

RAS是一种激素内分泌系统，是体内调节体液平衡、摄盐和血压的重要系统，可通过多种途径来影响人体血压[9～11]。AGT是RAS的重要活性成分之一。AGT基因有可能是子痫前期发病的易感基因。AGT是肾素作用的惟一底物，是血管紧张素Ⅱ(AT-Ⅱ)惟一的前身物质，是所有血管紧张肽的独特底物[12]；作为血管紧张素肽类的细胞外储备，其活性变化可限制AT-Ⅱ的转化速度。因此，AGT在RAS中具有举足轻重的作用。AGT的相对分子质量为49.8×103，与肾素位点相近，其编码基因位于常染色体1q42～43处，长度约12 kb。Jeunemaitre等[13]研究发现，AGT基因结构上存在16个多态性位点，除3′端存在二核苷酸重复序列(GT)n多态性外，其他15个均为单碱基变异，其中5种位于5′非翻译区、10种为编码区的无义或错义突变。目前研究最广泛、最深入的位点是M235T，位于第2个外显子704位核苷酸处，该位点处胸腺嘧啶被胞嘧啶所取代，导致编码产物第235位氨基酸由蛋氨酸变为苏氨酸。这个位点突变可影响AGT活性，继而造成机体对某些疾病的易感性增加。有研究认为，AGT基因M235T位点多态性与重度子痫前期的发病有关，但目前还存在争议。

本研究结果发现，两组AGT基因M235T位点基因型和等位基因分布比较差异均有统计学意义。表明AGT基因M235T位点多态性与重度子痫前期的发病有关，与Zitouni等[14]研究结果一致。本研究结果还发现，两组在校正高血压史这一混杂因素后，MT基因型者罹患重度子痫前期的危险性是MM基因型者的2.284倍；TT基因型者罹患重度子痫前期的危险性是MM基因型者的3.910倍。表明AGT基因M235T位点MT基因型和TT基因型可增加罹患重度子痫前期的风险，与宋成文等[15]研究结果相似。两组MM、MT、TT基因型理论值与实际值比较差异均无统计学意义，符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，说明研究对象具有群体代表性。但重度子痫前期的发病受多基因、多因素影响，国内外学者对AGT基因M235T位点多态性的研究结果存在分歧，可能是由于该位点多态性存在种族差异[16]，也可能与样本数量或样本选择有关。

综上所述，AGT基因M235T位点多态性与重度子痫前期的发病有关，尤其是TT基因型。本研究从遗传学角度观察了AGT基因M235T位点多态性与重度子痫前期发病的关系，这为研究重度子痫前期的发病机制提供了一定分子遗传学依据。