HPLC法同时测定胎乐颗粒中5种成分含量

潘涛　欧阳波　蔡霈　杨磊　张志国　肖作奇

[摘要] 目的 建立高效液相色谱法（HPLC）同时测定胎乐颗粒中5种成分（甘草苷、金丝桃苷、黄芩苷、黄芩素和五味子醇甲）的含量。 方法 梯度洗脱，乙腈-0.1%磷酸水溶液为洗脱体系，检测波长270 nm，总流速1.0 mL/min，进样量10 μL，柱温为30℃。 结果 甘草苷、金丝桃苷、黄芩苷、黄芩素和五味子醇甲分别在1.96～19.58 μg/mL（r = 0.9999）、1.65～16.52 μg/mL（r = 0.9998）、11.71～117.12 μg/mL（r = 0.9999）、1.63～16.26 μg/mL（r = 0.9999）和1.23～12.28 μg/mL（r = 0.9999）范围内呈良好的线性关系，平均加样回收率（RSD）分别为101.75%（0.98%）、102.32%（1.70%）、98.03%（1.35%）、99.52%（1.54%）和100.12%（1.27%）。 结论 该方法简单易行，可用于胎乐颗粒的质量控制。

[关键词] 胎乐颗粒;高效液相色谱;含量测定;黄芩苷;金丝桃苷

[中图分类号] R917          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）05（c）-0100-05

[Abstract] Objective To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for the simultaneous determination on the contents of five constituents （liquorice， hyperoside， baicalin， baicalein and schisandrin） in Taile Granules. Methods The acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution was eluted by gradient elution. The detection wavelength was 270 nm， the total flow rate was 1.0 mL/min， the injection volume was 10 μL， and the column temperature was 30℃. Results Liquorice， hyperoside， baicalin， baicalein and schisandrin showed good linear relationships within the ranges of 1.96-19.58 μg/mL （r = 0.9999）， 1.65-16.52 μg/mL （r = 0.9998）， 11.71-117.12 μg/mL （r = 0.9999）， 1.63-16.26 μg/mL （r = 0.9999） and 1.23-12.28 μg/mL （r = 0.9999）， whose average recoveries （RSD） were 101.75% （0.98%）， 102.32% （1.70%）， 98.03% （1.35%）， 99.52% （1.54%） and 100.12% （1.27%）， respectively. Conclusion This method is simple and can be used for the quality control of Taile Granules.

[Key words] Taile Granules; High performance liquid chromatography; Content determination; Baicalin; Hyperoside

胎乐颗粒是湖南省妇幼保健院临床经验方，由黄芩、菟丝子、山药、墨旱莲、五味子、甘草等十味中药组成，具有固肾安胎功效，临床上用于先兆流产的治疗，疗效显著[1]。现代药理学研究结果证明，黄芩具有抑制子宫平滑肌收缩的作用[2]，菟丝子有修复及保护卵巢功能的作用[3]，甘草有镇静解痉作用[4]，五味子具有益肾养心的功效，全方配合起到固肾调冲安胎的作用。本课题组前期研究仅对胎乐颗粒中1种成分黄芪甲苷的含量进行了质量控制[5]，尚无多指标含量测定的方法，不能对该制剂形成较为全面的质量控制。基于此，参考相关文献[6-15]，本研究选用高效液相色谱法（HPLC）对方中甘草苷、金丝桃苷、黄芩苷、黄芩素、五味子醇甲等5种成分的含量进行测定，为其质量控制提供方法学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（日本岛津，LC-10AT型）;二极管阵列检测器（日本岛津，SPD-M20A型）;色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent TC-C18）;电子分析天平（Mettler Toledo，d = 0.01 mg）;超声清洗器（宁波新芝生物科技有限公司，SB-80）。

1.2 试药

水（娃哈哈纯净水）;乙腈、甲醇（Tedia，色谱纯）。胎乐颗粒（批号：20180401、20180416、20180412）由湖南省妇幼保健院药学制剂部提供。甘草苷（161013-160724）、金丝桃苷（111521-201507）、黄芩苷（110715-200514）、黄芩素（111595-200604）、五味子醇甲（110857-201211）等标准物质购于中国食品药品检定研究院。黄芩、菟丝子、山药、墨旱莲、五味子、甘草等中药饮片购自衡东县中药饮片厂（由湖南省中医院王竹鑫主任中药师验收合格）。其余试剂均為分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

流动相A为乙腈，B为0.1%磷酸水溶液。检测波长270 nm。总流速1.0 mL/min，进样量10 μL，柱温为30℃。梯度洗脱程序见表1，色谱图见图1。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备  分别精密称取甘草苷、金丝桃苷、黄芩苷、黄芩素和五味子醇甲标准物质适量，于不同容量瓶中，甲醇定容，即为对照品溶液。另称取甘草苷、金丝桃苷、黄芩苷、黄芩素和五味子醇甲标准物质适量，于同一容量瓶中，甲醇定容，甘草苷、金丝桃苷、黄芩苷、黄芩素和五味子醇甲溶度分别为9.79、8.25、58.56、8.13、6.14 μg/mL，即为混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液  精密量取本品1.0 g，置50 mL容量瓶中，甲醇定容，精密称重，摇匀，超声处理30 min，放冷，加入甲醇补足损失重量，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得供试品溶液。

2.3 专属性考察

阴性对照溶液制备：按处方量取缺甘草其他各味药材，按胎乐颗粒的制备工艺制成颗粒，取本品1.0 g，置50 mL容量瓶中，甲醇定容，精密称重，摇匀，超声处理30 min，放冷，加入甲醇补足损失重量，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得甘草阴性对照品溶液。同法分别制得缺菟丝子阴性对照溶液、缺黄芩阴性对照溶液和缺五味子阴性对照溶液。

分别取阴性对照溶液，按“2.1”项下条件进行HPLC分析，色谱图见图1，结果表明阴性样品对相关成分含量测定无干扰，专属性好。

2.4 线性关系考察

配制一系列浓度的甘草苷、金丝桃苷、黄芩苷、黄芩素和五味子醇甲对照品溶液进行HPLC测定，得到甘草苷的线性方程回归方程为：Y = 18 300X + 3623.2， r = 0.9999，线性范围为1.96～19.58 μg/mL;金丝桃苷的线性方程回归方程为：Y = 23 026X + 3178，r = 0.9998，线性范围为1.65～16.52 μg/mL;黄芩苷的线性方程回归方程为：Y = 125 072X + 14629，r = 0.9999，线性范围为11.71～117.12 μg/mL;黄芩素的线性方程回归方程为：Y = 87 254X + 1586.7，r = 0.9999，线性范围为1.63～16.26 μg/mL;五味子醇甲的线性方程回归方程为：Y = 18 460X + 2144.6，r = 0.9999，线性范围为1.23～12.28 μg/mL。其中Y为峰面积，单位mAU·s，X为浓度，单位μg/mL。

2.5 精密度试验

取“2.2.1”项下所制备的对照品溶液，适当稀释，按“2.1”项下条件分别重复进样6次，测得甘草苷峰面积RSD = 1.0%，金丝桃苷峰面积RSD = 0.8%，黄芩苷峰面积RSD = 1.1%，黄芩素峰面积RSD = 0.9%，五味子醇甲峰面积RSD = 1.0%，表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验

取“2.2.2”项下所制备的供试品溶液（批号：20180 401），按“2.1”项下条件分别于0、2、4、6、8、12 h进行HPLC检测，结果测得甘草苷峰面积RSD = 1.5%，金丝桃苷峰面积RSD = 1.3%，黄芩苷峰面积RSD = 1.7%，黄芩素峰面积RSD = 1.3 %，五味子醇甲峰面积RSD = 1.3%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一批次胎乐颗粒（批号：20180401），精密称重，按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法平行制备6批供试品溶液，分别按“2.1”项下条件进行HPLC检测，记录峰面积，计算甘草苷、金丝桃苷、黄芩苷、黄芩素和五味子醇甲的含量，结果甘草苷含量RSD = 1.6%，金丝桃苷含量RSD = 1.6%，黄芩苷含量RSD = 1.7%， 黄芩素峰含量RSD = 1.4 %，五味子醇甲含量RSD = 1.4%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收试验

取已知含量的胎乐颗粒（批号：20180401），每份约0.5 g，并且每一份分别精密加入甘草苷、金丝桃苷、黄芩苷、黄芩素和五味子醇甲适量，按“2.2.2”供试品溶液的制备方法，制备供试品溶液，按“2.1”色谱条件进行HPLC分析，记录峰面积，并计算分析结果，结果见表2。结果甘草苷、金丝桃苷、黄芩苷、黄芩素和五味子醇甲的回收率分别为101.75%、102.32%、98.03%、99.52%和100.12%，RSD值分别为0.98%、1.70%、1.35%、1.54%和1.27%，说明本方法加样回收率较好，可用于含量测定。

2.9 样品的测定

取3批次胎乐颗粒样品，按“2.2.2”供試品溶液的制备方法，参照“2.1”～“2.7”方法测定样品中甘草苷、金丝桃苷、黄芩苷、黄芩素和五味子醇甲含量，测定结果见表3。

3 讨论

色谱条件的选择：本研究考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸水溶液、甲醇-甲酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液等洗脱体系，经比较，发现乙腈-0.1%磷酸水溶液分离效果较佳，所以最后选择乙腈-0.1%磷酸水溶液作为洗脱体系，并优化得到最佳洗脱程序，甘草苷、金丝桃苷、黄芩苷、黄芩素和五味子醇保留时间分别为39.0、43.2、62.8、90.6、113.3 min。

检测波长的选择：本研究通过扫描甘草苷、金丝桃苷、黄芩苷、黄芩素和五味子醇在200～400 nm之间的吸收值，同时对比供试品的DAD检测图谱，发现目标峰在254 nm和350 nm处有轻微干扰，270 nm处均有吸收，且分离度佳，最后选择270 nm处为检测波长。

先兆流产属于祖国医学“胎漏”“胎动不安”的范畴，是妇科常见病、多发病之一[16-20]。临床实践表明，胎乐颗粒对先兆流产有明显疗效[21-22]。本研究采用HPLC法建立胎乐颗粒多指标成分的含量测定方法，操作简单，快速准确，为该制剂更好地服务临床提供保障。

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