食管鳞癌新辅助化放疗敏感性相关血清microRNA的检测及临床应用价值

杨鲸蓉　吴健　叶仕新　连铎煌　曾志勇

[摘要] 目的 探讨血清microRNA（miRNA）与食管鳞癌新辅助化放疗（NCRT）效果的关系及其预测价值。 方法 选取南京军区福州总医院2015年1月～2016年12月收治的接受术前NCRT的cT3-4N0食管鳞癌患者30例，NCRT前采集患者外周血，根据术后病理结果，分为敏感组和抵抗组，每组各15例;采用miRNA表达谱芯片检测筛选出食管鳞癌NCRT敏感组和抵抗组差异表达的血清miRNA，然后，扩大样本量进行实时荧光定量PCR验证初筛的血清miRNA;分析筛选并验证的miRNA和NCRT效果的关系;受试者工作特征（ROC）曲线评价miRNA预测NCRT效果的价值。 结果 两组患者血清共筛查出16个差异表达的miRNA，其中miRNA-23，miRNA-211，miRNA-323经qRT-PCR验证后，差异有统计学意义（P < 0.05）。三者与食管鳞癌NCRT近期效果的曲线下面积分别为0.764、0.880和0.707。 结论 miRNA-23、miRNA-211和miRNA-323对食管鳞癌NCRT近期效果的评估可能具有一定的预测价值。

[关键词] 食管鳞癌;新辅助化放疗;微小RNA;临床应用

[中图分类号] R735.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）05（b）-0096-05

[Abstract] Objective To investigate the relationship between serum microRNA（miRNA） and neoadjuvant radiotherapy （NCRT） for esophageal squamous cell carcinoma and its predictive value. Methods From January 2015 to December 2016， 30 patients with preoperative NCRT cT3-4N0 esophageal squamous cell carcinoma admitted to Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command were selected. Peripheral blood of the patients were collected before NCRT. According to the postoperative pathological results， the patients were divided into the sensitive group and the resistance group， with 15 cases in each group. The differentially expressed serum mirnas in the NCRT sensitive group and the resistance group were detected by miRNA expression profile microarray. Then， the sample size was expanded for real-time fluorescence quantitative PCR to verify the initially screened serum mirnas. The relationship between the efficacy of miRNA and NCRT was analyzed and verified. Subject operating characteristic （ROC） curves were used to evaluate the value of miRNA in predicting the efficacy of NCRT. Results A total of 16 differentially expressed mirnas were detected in the serum of the two groups， among which miRNA-23， miRNA-211 and miRNA-323 were verified by qRT-PCR， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. The area under the curve of the short-term efficacy of the three factors and esophageal squamous cell carcinoma NCRT was 0.764， 0.880 and 0.707， respectively. Conclusion The evaluation of miRNA-23， miRNA-211 and miRNA-323 in the short-term efficacy of esophageal squamous cell carcinoma NCRT may have certain predictive value.

[Key words] Esophageal squamous cell carcinoma; Neoadjuvant chemoradiation; microRNA; Clinical application

我國食管鳞癌最为常见。对可切除的食管癌患者而言，外科治疗是食管癌治疗的首选方法。但食管癌患者单纯手术生存率低，效果不尽人意。为提高食管癌治疗效果，多项研究[1-2]表明，术前新辅助化放疗（neoadjuvant chemoradiation，NCRT）可显著提高局部进展期食管癌患者的5年生存率，改善预后。术前NCRT可提高食管癌患者生存率，但主要获益者是NCRT敏感者。而NCRT抵抗的食管癌患者失去最合适的手术切除机会，预后甚至比单纯手术更差。目前研究[3-8]表明，miRNA的差异表达与肿瘤化疗/放疗敏感性有着密切联系。本研究通过miRNA表达谱芯片检测食管鳞癌NCRT敏感和抵抗患者差异表达的血清miRNA;然后，扩大样本量进行RT-PCR验证，旨在寻找潜在的预测食管癌NCRT敏感性的生物学标志物。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取福建省福州总医院（以下简称“我院”）2015年1月～2016年12月收治的30例接受术前NCRT的食管癌患者为研究对象。纳入标准：内镜活检组织病理学提示食管鳞状细胞癌;局部进展期食管癌，T3～4或淋巴结阳性的可切除胸段食管癌患者;无明显化疗、放疗及手术禁忌证;NCRT后4～6周行食管癌切除术;能签署治疗知情同意书，对治疗和随访有良好的依从性。排除标准：不满足任一纳入标准者;其他部位恶性肿瘤史;严重心血管疾病，严重肝肾功能障碍及其他不能耐受化放疗的合并症者;出现严重治疗相关并发症，不能继续治疗或常规随访;患者中途放弃治疗;失访。本研究经我院医学伦理委员会审核批准，且入选者均已签署知情同意书。本入研究中，NCRT敏感组15例，NCRT抵抗组15例。两组患者年龄、性别、部位、肿瘤临床分期、组织学分级等一般资料比较，差异均无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。见表1。

1.2 治疗方法

采用常规分割放疗200 cGy/d，每周5 d，共20次，总量40 Gy。靶区包括肿瘤靶区和临床靶区，即原发食管肿瘤病灶、转移淋巴结和亚临床病灶（食管肿瘤上下3 cm正常食管及食管旁淋巴引流区）。放疗同期采用DP方案：多西他赛（江苏恒瑞医药股份有限公司生产，10 mg/支，批号：16060116）75 mg/m2，静脉滴注（2～3 h），第1天;顺铂（江苏豪森药业股份有限公司生产，30 mg/支，批号：160402）75 mg/m2，静脉滴注（2 h），第1～3天。21 d为1个周期，共2次。然后，间隔4～8周进行食管癌根治术。

1.3 NCRT方案效果的评估

根据NCRT后4～6周行微创食管癌切除术后病理结果评估NCRT效果[9-10]。NCRT后病理反应分级是通过残留肿瘤细胞与周围纤维组织的比例来划分的。肿瘤退缩1级（TRG1）为无肿瘤细胞残留;肿瘤退缩2级（RRG2）为残留肿瘤细胞占1%～10%;肿瘤退缩3级（TRG3）为残留肿瘤细胞占11%～50%;肿瘤细胞退缩4级（TRG4）为残留肿瘤细胞占50%以上;肿瘤退缩5级（TRG5）为无肿瘤退缩改变。目前研究[11-12]表明病理完全缓解和TRG2（TRG1～2）患者可从新辅助治疗中获益。因此本研究将TRG1～2纳入治疗敏感组，TRG3～5为抵抗组。

1.4 实验方法

1.4.1 血清标本收集  符合纳入标准的患者在接受NCRT前，征得患者同意后由临床医师收集食管癌术前NCRT敏感组和抵抗组患者的外周血5 mL，EDTA抗凝，低温低速离心机1000 r/min离心10 min，取匀浆上清，于无RNA酶EP管中-70℃低温保存。

1.4.2 miRNA芯片初筛  3例食管癌NCRT敏感者血清和3例NCRT抵抗者血清标本送至上海康成生物工程有限公司进行miRNA表达谱芯片检测。首先应用Trizol法提取RNA，并用RNasey Mini kit（QIAGEN）純化。使用NanoDrop ND-1000测量纯化后的RNA浓度，电泳检测RNA完整性。RNA标记和杂交根据Exiqon提供的方法进行。抽提的RNA通过质检后，使用miRCURYTM Array Power Labeling kit（Cat #208032-A，Exiqon）对miRNA进行标记。标记完成后，将样品与miRCURYTM LNA Array（v.19.0）（Exiqon）芯片杂交，杂交完成后，使用Wash buffer kit（Exiqon）清洗芯片。最后使用Axon GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片。结果经过数据分析，根据差异倍数≥1.5且P < 0.05筛选与NCRT敏感患者血清相比在NCRT抵抗患者血清中差异表达的miRNA。

1.4.3 Real-time PCR检测miRNA的表达  提取剩余患者血清RNA，按Qiagen公司的miRNaesy Mini Kit说明书进行操作。在miRBase数据库种获取目标miRNA的引物，利用茎环引物逆转录合成cDNA第一链。以合成的cDNA作为模板进行实时定量PCR扩增（同时测定每个样品中hsa-miRNA-93-5p含量作为内参以校正上样误差）。分析实时定量PCR结果，根据标准曲线定量样品中的目的miRNA。以hsa-miRNA-93-5p作为内参，数据采用2-ΔΔCT法进行分析。实验重复3次。

1.5 统计学方法

应用SPSS 19.0对资料进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，符合正态分布时，两组数据比较用t检验;两组计数资料比较采用χ2检验;等级资料采用非参数秩和检验;应用受试者工作特征（ROC）曲线评价目标miRNA的表达在食管鳞癌NCRT效果预测中的临床价值。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管鳞癌术前NCRT敏感组和抵抗组患者血清miRNA表达谱比较

表达谱芯片杂交后，结果经过分析，根据改变倍数≥1.5且P < 0.05筛选出食管鳞癌术前NCRT敏感组和抵抗组患者中有差异表达的miRNA。共检测出112个差异表达的miRNA，其中18个表达上调，94个表达下调。其中共有16种miRNA在食管癌术前NCRT敏感组和抵抗组血清标本中差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。其中上调表达的有3种，下调表达的miRNA有13种。差异表达有统计学意义的miRNA的热图。见图1（封四）。

2.2 qRT-PCR对miRNAs进行验证

用qRT-PCR对16种miRNA进行验证。其中miRNA-211-5p、miRNA-323b-3p和miRNA-23c 三个miRNA在食管癌术前NCRT敏感组患者中的表达相对于抵抗组的表达差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

2.4 ROC曲线分析

以手术切除后组织的病理报告为“金标准”，评估食管鳞癌患者行术前NCRT是否敏感。绘制miRNA-23c、miRNA-211-5p和miRNA-323b-3p在预测食管癌术前NCRT敏感性的ROC曲线。见表4、图2。

3 讨论

术前NCRT可提高食管癌患者生存率，但主要获益者是NCRT敏感者，而NCRT抵抗的食管癌患者预后甚至比单纯手术更差。因此，如果治疗前能预测食管癌NCRT效果，筛选出NCRT敏感人群，则可对食管癌患者进行分层;使对NCRT敏感者从NCRT中获得最大利益;NCRT抵抗者则可建议其他治疗模式，规避NCRT毒副作用的危害;从而提高食管癌的总体效果，改善预后。目前预测食管NCRT效果及预后相关因素有：食管癌的病理分型，分化程度等临床因素，另外，从分子层面进行食管癌NCRT预后因素的探索，是近年来的研究热点，如抑癌基因、细胞周期调节因子、DNA损伤修复基因、耐药蛋白、血管生成因子等[13-14]。但至今，未找到高度敏感而又经济有效的可预测食管癌NCRT效果的生物学标志物。microRNA（miRNA）是一类具有内源性、功能性的非编码RNA。目前有研究[3-8]表明，miRNA的差异表达与肿瘤化疗/放疗敏感性有着密切联系。本研究通过miRNA表达谱的筛查分析食管鳞癌NCRT敏感组和抵抗组血清miRNA表达存在统计学意义（P < 0.05），首次阐明血清miRNA表达谱与食管鳞癌NCRT效果的关系，筛选出可预测食管鳞癌NCRT效果的血清miRNA。

miRNA预测食管癌NCRT效果的既往研究少有报道。Skinner等[3]筛选出miRNA：miRNA-505，miRNA-99b、miRNA-451、miRNA-145与食管癌NCRT相关，并通过建立miRNA表达谱评分并结合T分期、肿瘤分级来预测食管腺癌NCRT的有效性。Bibby等[4]研究表明miRNA-330-5p可作为食管腺癌的NCRT敏感性的预测生物学标志物，并可作为NCRT敏感性的一种新的治疗靶点。Odenthal等[5]研究表明血清miRNA-222和miRNA-302c可作为胃食管连接部腺瘤的综合治疗效果的预测。Ko等[6]研究了25例Ⅲ期食管癌（鳞癌、腺癌）NCRT前后miRNA的差异表达，在病理完全缓解组和非病理完全缓解组，有5种miRNA（HS-240、hsa-miRNA-296、hsa-miRNA-31、hsa-miRNA-31和HS-217）的表达差异超过2倍，但并未进一步筛选并证明可作为预测食管癌NCRT的miRNA。本研究中共筛查出16种miRNA在食管癌术前NCRT敏感组和抵抗组血清标本中差异有统计学意义（P < 0.05），其中上调表达的有3种，下调表达的miRNA有13种。通过qRT-PCR进一步验证。其中miRNA-211-5p、miRNA-323b-3p和miRNA-23c 三个miRNA在食管癌术前NCRT敏感组患者中的表达相对于抵抗组的表达差异有统计学意义（P < 0.05）。这与既往研究[3-6]结果并不一致，可能的原因是既往研究对象均包含食管腺癌患者，而本研究仅选取的是我国常见的食管鳞癌患者。另外患者入组条件，NCRT效果分组标准也有所不同，当然本研究样本量小也是一个因素，仍需要大样本量的研究。

本研究中miRNA-211在食管鳞癌NCRT敏感组较抵抗组差异表达下调，定量分析其差异倍数为1.5倍。而关于miRNA-211与NCRT近期效果的分析提示敏感组的miRNA-211低表达率为86.7%，高于抵抗组的26.7%，提示miRNA-211下调表达量越低，NCRT越高。本研究进一步使用ROC曲线评价miRNA-211对于食管鳞癌NCRT敏感性的预测价值，曲线下面积为0.880，具有较好的诊断效能。Shafiee等[7]研究表明miRNA-211的过表达可引起食管鳞癌细胞SOX2OT和SOX2基因的下调，而SOX2OT和SOX2基因在肿瘤发生和多能性中有重要的作用。Zhang等[8]研究表明上调miRNA-211-5p可显著抑制细胞和恢复化疗敏感性。Asuthkar等[15]研究表明miRNA-211上调或者下调MMP-9，可增强化放疗治疗效果。

既往报道miRNA-323与胰腺癌、前列腺癌和甲状腺癌相关[16-17]，但在食管癌中鲜有报道。miRNA-323的缺失使PC-3前列腺癌细胞在G0/G1期停滞，并引起显著的凋亡。多西紫杉醇耐药的前列腺癌细胞miRNA-323表达水平较亲本细胞高5.6倍。miRNA-323的过表达使前列腺癌细胞对多西紫杉醇的抑制浓度（IC50）值增高了50%[16]。本研究探讨了miRNA-323与食管鳞癌的关系。在食管鳞癌NCRT敏感组患者血清miRNA-323呈下调趋势，进一步定量两组之间的差异倍数为1.22倍。ROC曲线下面积为0.707，提示miRNA-323在预测食管鳞癌NCRT效果方面有一定的价值。

miRNA-23参与包括神经系统和消化系统等多种肿瘤的发生与发展过程，常起致癌基因的作用。Shang等[18]研究發现miRNA-23a对结肠癌细胞氟尿嘧啶的敏感性具有明显的抑制作用;抑制miRNA-23的表达可增加卵巢癌细胞对顺铂的敏感性，引起细胞周期阻滞G0/G1期，增加细胞凋亡率[19]。另外，辐射诱导的胸腺淋巴瘤组织样本中miRNA-23 a和miRNA-23 b上调，而miRNA-23a/b模拟物则淋巴瘤细胞死亡和凋亡。这可能与miRNA-23a/b的过表达降低了Fas蛋白的表达水平有关[20]。本研究中miRNA-23在食管鳞癌NCRT敏感组中呈下调表达，定量分析其差异倍数为1.31倍。本研究进一步使用ROC曲线评价miRNA-23在食管鳞癌NCRT预测效果价值，ROC曲线下面积为0.764。提示miRNA-23对NCRT敏感性有一定的预测价值。

綜上所述，本研究通过miRNA表达谱芯片检测食管鳞癌NCRT敏感组和抵抗组差异表达的血清miRNA;共筛查出16种miRNA在食管癌术前NCRT敏感组和抵抗组血清标本中差异有统计学意义（P < 0.05），其中上调表达的有3种，下调表达的miRNA有13种。通过qRT-PCR进一步验证。其中miRNA-211-5p、miRNA-323b-3p和miRNA-23c这3个miRNA在食管癌术前NCRT敏感组患者中的表达相对于抵抗组的表达差异有统计学意义（P < 0.05）。结合临床资料，通过准确性检验分析（ROC曲线）判断上述3种血清miRNA在预测食管鳞癌NCRT效果的价值。后续仍需要通过进一步扩大样本量来进行验证结果，并探讨其参与化放疗敏感性调节的作用机制。

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（收稿日期：2018-09-14  本文编辑：封   华）