风心病合并房颤患者心肌microRNA表达谱分析与靶基因预测

韩莉莉+沈晓丽+赖力+林赛梅+刘小晴+翁国星+陈同+丁杭+胡洁+浦晓东

[摘要] 目的 研究风心病合并房颤患者心肌microRNAs的表达差异，预测其靶基因并分析其可能的生物学功能。方法经知情同意，整群采集2013年1—12月收治的14例住院风心病房颤患者和8例风心病无房颤患者右心耳组织；提取总RNA进行miRNAs芯片杂交检测，应用RMA和FC法筛选差异表达的miRNAs，并用RT-PCR进行验证；运用生物信息学软件预测靶基因并分析其生物学功能。结果 与风心病无房颤组相比，风心病合并房颤组有22个miRNAs表达有差异，其中6个miRNAs表达上调，16个miRNAs表达下调；验证结果表明与风心病无房颤组比较，miR-661、miR-520d-5p和miR-145-5p表达显著下调（P<0.01）；经GO和KEGG数据分析，差异miRNA 靶基因的一部分亦与心肌纤维化相关。结论 该研究获得与房颤相关的差异miRNAs，可能是房颤新的生物标志物和潜在治疗靶点。

[关键词] 房颤；微小RNA；表达谱；生物信息学

[中图分类号] R4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）02（c）-0007-04

Analysis of Myocardium MicroRNA Expression Profile and Prediction of Target Gene of Patients with Rheumatic and Atrial Fibrillation

HAN Li-li1， SHEN Xiao-li1， LAI Li1， LIN Sai-mei1， LIU Xiao-qing1， WENG Guo-xing2， CHEN Tong2， DING Hang1， HU Jie1， PU Xiao-dong1

1.Clinical Medical College of Medical University of Fujian， Fujian Key Laboratory of Cardiovascular Disease， Judicial Appraisal Institute of Fujian Province-owned Hospital， Fuzhou， Fujian Province， 350001 China；2.Department of Cardiac surgery， Fujian Provincial Hospital， Fuzhou， Fujian Province， 350001 China

[Abstract] Objective To research the expression difference of myocardium microRNA of patients with rheumatic and atrial fibrillation and predict the target gene and analyze the potential biology function. Methods Auricula dextra tissues of 14 cases of inpatients with rheumatic and atrial fibrillation and 8 cases of patients were group selected with rheumatic but without atrial fibrillation from January to December 2013 were collected， and the total RNA was extracted for miRNAs hybridization test， and the miRNAs was screened by RMA and FC， and then RT-PCR was used for verification， and the target gene was predicted by the biology information software and the biology function was analyzed. Results The expression of 22 miRNAs had differences in the combined group， including 6 whose expression increased and 16 whose expression decreased， and the expressions of miR-661， miR-520d-5p and miR-145-5p obviously decreased compared with the other group， all P<0.01， the GO and KEGG data analysis showed that the some of differential miRNA target genes was correlated with the myocardial fibrosis. Conclusion The differential miRNA related to atrial fibrillation may the new biomarkers of atrial fibrillation and potential treatment target point.

[Key words] Atrial fibrillation； mini RNA； Expression profile； Information biology

風湿性心脏病是因风湿活动引起的心脏病变，常导致房颤发生。房颤（Atrial Fibrillation ，AF），是多因素导致的心律失常[1]。微小RNA（miRNA）是长约22个核苷酸的非编码单链RNA，可使靶mRNA降解或者抑制其翻译而在转录后和翻译水平发挥调控作用，继而影响细胞增殖分化和凋亡等[2]。既往研究miR-30、miR-21、miR-150和miR-146[3-4]等可能参与AF， 而miRNA在AF心肌纤维化的作用尚缺少研究。通过分析2013年1—12月收治的22例风心病瓣膜置换者miRNAs表达，该研究拟寻找新的调控AF心肌纤维化的miRNAs并预测其靶基因，为进一步揭示miRNAs在AF的作用机制及寻求安全、有效诊治AF的靶点提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

整群选择该院心外科接受风心病瓣膜置换的患者，知情同意后入选。分两组：风心病合并房颤组14例，风心病无房颤组8例。采集患者右心耳心肌组织放入液氮冻存备用。

1.2 RNA抽提

Trizol法提取总RNA并检测其质量和含量，用琼脂糖电泳检测其完整性，质控标准：1.70.7，合格者用于后续研究。

1.3 miRNA芯片杂交

先分析总RNA，然后选用FlashTag Biotin HSR 标记试剂对样品进行标记后杂交，继而用 GeneChip杂交洗染试剂来洗染芯片，最后扫描得到图片和原始数据。

1.4 芯片结果的RT-PCR验证

1.4.1 引物设计 扩大样本量，挑取6个差异miRNAs进行组织验证，用Primer 5.0设计引物，U6 为内参照，见表1。

1.4.2 RT-PCR 扩增 反应体系为20 μL，10μL SYBR premix ex taq，0. 5 μL 上、下游引物（2.5 μM） ，8 μL H2O，加入1 μL cDNA 后混匀。循环条件为： DNA变性1 个循环：95℃ 30 s，目标DNA扩增45个循环：95℃ 5 s、60 ℃，30s，反应结束后制作熔解曲线。

1.5 靶基因预测和功能分析

采用targetscan、miRDB与mimada 3种软件对差异表达miRNA靶基因进行预测。基于Gene Ontology数据库，通过GO分析对靶基因进行GO分类，再通过KEGG数据库分析靶基因的信号通路及功能分布，初步了解差异miRNAs对AF发生、发展的调控情况。

1.6 统计方法

采用RMA方法和倍数变化法（FC）筛选差异miRNAs，判断标准为|FC|>2或|FC|<0.5。荧光定量PCR 数据采用2 - ΔΔCt法分析，采用SPSS 13.0统计学软件对计量资料进行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA表达谱芯片数据分析结果

miRNA表达谱芯片检测显示，该研究中与风心病无房颤组相比，风心病合并房颤组患者有16个miRNAs（miR-520d-5p、miR-661、miR-4490、miR-4474-3p、miR-4518、miR-379*、miR-3939、miR-1243、miR-4793-3p、miR-548c-3p、miR-4711-5p、miR-4754、miR-4677-5p、miR-4423-3p、miR-145*、miR-1252）相对表达下调，6个miRNAs相对表达上调（miR-4800-3p、miR-3174、miR-4723-5p、miR-218-2*、miR-920、miR-4470）（P<0.05）。

2.2 Real-time PCR验证结果

选择6条miRNAs做组织验证，结果与风心病无房颤组相比，风心病有房颤组中miR-661、miR-520d-5p和miR-145-5p表达显著下调（P<0.01），与芯片结果一致；而miR-4800-3p、miR-1243和miR-4723在两组表达差异无统计学意义，与芯片结果不一致，不适于进一步功能研究，见表2。

注：与风心病无房颤组比较，*P<0.01。

2.3 miRNA靶基因的预测和功能分析

通过分析差异miRNA的靶基因，选择3个数据库共同预测得出有交集的靶基因， miR-661、miR-145-5p和hsa-520d-5p靶基因分别有44、227个和491个，具体分布及重叠情况见图1。

A.miR-661靶基因 B. miR-145-5p靶基因

C. miR-520d-5p靶基因

通过在Pubmed检索并对照《人类基因功能手册》，确定上述差异miRNA最有可能的靶基因，见表4。

基于 Gene Oncology和KEGG数据库，进行GO和Pathway分析，结果除涉及核酸、蛋白代谢外，这些靶基因生物学途径还涉及信号转导（Wnt通路为主）及胞外基质合成，此外也参与了心脏组织发育、细胞增殖，调节粘附、转录因子活性及炎症等。

3 讨论

miRNA是近年來生命科学研究的热点，既往对其研究主要集中在生物发生等方面，在心血管疾病中的研究起步较晚。虽然已发现多种在心血管发育及疾病病理发生过程中发挥非常重要作用的miRNAs，但有关房颤和心肌细胞外基质纤维化研究较少，而且绝大多数是动物实验的结果。因此，该研究选择风心病接受瓣膜置换患者右心耳组织作为实验材料，探讨了miRNAs在房颤发生发展的机制，实验结果更具真实性。

寡核苷酸芯片具有特异性和敏感性高、重复性好、假阳性率低等优点，在心肌组织miRNA分析中得到广泛应用。RT-PCR验证结果发现风心病房颤组较风心病无房颤组miR-520d-5p、 miR-661和miR-145-5p表达显著下调（P<0.01），与芯片结果一致；而另3种miRNA在两组表达差异无统计学意义，与芯片结果不一致，可能原因有：①基因芯片具有高通量优势也存在假阳性的不足之处，②FC法筛选差异miRNAs具有简便、节约成本等优点，也存在结论过于简单、阈值划分主观性较强等缺点，易产生假性结果[5]，适用于预实验和实验初筛。

既往有关miRNAs与AF的研究中，Liu Z等[6]报道miR-188-5p、miR-1181等8条表达上调，miR-497、miR-145等20条下调。另有报道miR-17、miR-10b、等5条miRNA表达上调；miR-30c、miR-100等5条miRNA表达下调[7]。该研究首次发现miR-661和miR-520d-5p与AF有关，且与风心病无房颤患者相比，风心病合并房颤患者上述miRNA表达水平降低。由于AF机制的复杂性，该研究推测AF形成可能是诸多miRNA调控下游靶基因的结果。

为进一步探讨差异miRNA调控预测靶基因的功能，该研究应用PubMed检索显示多数预测的靶基因尚未见与AF相关的报道，提示这些miRNA可能通过信号通路级联效应对AF进行调控。GO分析结果显示除涉及核酸、蛋白代谢外，miR-661靶基因生物学功能主要集中在细胞外基质的合成与代谢上，而胞外基質在调节心肌细胞收缩和胞间信息中起重要作用[8]，表明差异miRNA与AF发生有关。AF涉及电重构、结构重构等过程，其都涉及信号通路的调控。KEGG分析显示这些miRNA影响的靶基因主要在Wnt、细胞骨架、粘附连接和MAPK等信号通路上，尤以Wnt通路富集指数最高，Wnt通路可能是这些miRNA调控的核心通路。

综上所述，该研究为了解AF发生机制提供了新视野，miR-661、miR-520d-5p和miR-145-5p可作为检测AF的新的标志物，后续研究中也将进一步通过功能实验等探索其与靶基因的关系，以期为AF机制的研究及寻找安全、有效治疗AF的药物提供新的思路。

[参考文献]

[1] Lip GY， Tse HF， Lane DA. Atrial fibrillation[J].Lancet， 2012，379（9816）：648-661.

[2] Shi KH， Tao H， Yang JJ， et al. Role of microRNAs in atrial fibrillation： new insights and perspectives[J].Cell Signal， 2013，25（11）：2079-2084.

[3] Li H， Li S， Yu B，et al. Expression of miR-133 and miR-30 in chronic atrial fibrillation in canines[J].Mol Med Rep， 2012，5（6）：1457-1460.

[4] Goren Y， Meiri E， Hogan C，et al.Relation of reduced expression of MiR-150 in platelets to atrial fibrillation in patients with chronic systolic heart failure[J]. Am J Cardiol， 2014， 113（6）：976-981.

[5] 高利宏， 曹佳. 基因芯片可靠性分析及数据处理[J]. 第三军医大学学报， 2006，28（1）：80-82.

[6] Liu Z， Zhou C， Liu Y，et al.The expression levels of plasma micoRNAs in atrial fibrillation patients[J]. PLoS One， 2012，7（9）：e44906.

[7] Cooley N， Cowley MJ， Lin RC，et al.Influence of atrial fibrillation on microRNA expression profiles in left and right atria from patients with valvular heart disease[J].Physiol Genomics， 2012，44（3）：211-219.

[8] Shi KH， Tao H， Yang JJ，et al.Role of microRNAs in atrial fibrillation： new insights and perspectives[J]. Cell Signal， 2013，25（11）：2079-2084.

（收稿日期：2016-11-28）