焙炒对小粒黑大豆及其种皮抗氧化活性的影响

郭 颖 江 帆 乔丽华 王 华 梁鸡保 杜双奎

(西北农林科技大学食品科学与工程学院1，杨凌 712100)(渭南市食品执法监察支队2，渭南 714000)(神木市农业技术推广中心3，神木 719300)

小粒黑大豆是豆科植物大豆(GlycinemaxL.)的黑色种子，百粒重在10～15 g，具有适应性强，耐贫瘠、耐干旱，已成为黄土高原地区主要的食用大豆资源。小粒黑大豆具有有益于人体健康的生理功能，如对吞噬细胞有免疫作用、抗衰老、清除细胞活性氧、降低血脂、预防肥胖病和动脉硬化与抗血栓等[1-5]。但小粒黑大豆含有抗营养因子，因此在食用前，要经过熟制以去除抗营养因子，改善其食用品质。目前，小粒黑大豆的产品多以传统的豆腐制品、豆芽为主，为提高产品的感官商品价值，常将其黑色种皮脱除，研究表明黑大豆种皮中含有丰富的花青素、多酚等，但常作为饲料或废弃物遗弃，不仅浪费了宝贵资源，而且会造成环境污染，如何高效利用已成为大家关注的问题[6-8]。

焙炒作为传统的使物料熟化、增香的手段广泛应用于谷物、豆类等加工，是干热熟化加工的一种[9]。Acar等[10]将黑豆在150 ℃烘烤10、30、60 min后，研究发现其总抗氧化能力逐渐增强。Kim等[11]研究发现，与未处理的小粒黑大豆相比，150 ℃和250 ℃烤制过的小粒黑大豆有较高的DPPH·、ABTS+·清除率；经过烤制后，酚类物质和美拉德反应产物都有一定程度的增加，焙烤处理可以增加大豆异黄酮苷元的含量。本研究以小粒黑大豆、黑豆皮为实验材料，对其进行焙炒熟化处理，研究焙炒对小粒黑大豆、黑豆皮抗氧化活性和生物活性的影响，以期为小粒黑大豆、豆皮茶的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

小粒黑大豆、黑豆皮，由陕西榆林神木市农业技术推广中心提供。DPPH、TPTZ、2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、菲洛嗪、福林酚试剂、芦丁、甲硫氨酸、NBT(氯化硝基四氮唑蓝)、核黄素、一水没食子酸，其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 样品焙炒处理

取适量小粒黑大豆或黑豆皮在旋转焙炒锅中进行焙炒熟化处理。小粒黑大豆焙炒条件为150 ℃ 80 min和210 ℃ 50 min，黑豆皮焙炒条件为110 ℃ 35 min和150 ℃ 25 min，随后冷却至室温。取焙炒熟化后的样品粉碎过60目筛，收集筛下物4 ℃保存备用。

1.2.2 脱脂处理

称取5 g豆粉(豆皮)，置于100 mL的磨口锥形瓶中，按1∶10加入石油醚，封口，在25 ℃，以振荡频率为150 次/分的振荡器中振荡脱脂3 h，回收石油醚，再按比例加入石油醚重复脱脂2次。脱脂后的样品在通风橱中放置，挥去残留石油醚至无味，随后在35 ℃干燥16 h，将脱脂的样品装袋保存，备用。

1.2.3 抗氧化活性测定

1.2.3.1 提取液制备

参考Nithiyanantham等[9]方法制备提取液，略有改动。称取2 g脱脂样品，用25 mL 70%丙酮(丙酮∶水∶乙酸=70∶ 29.5∶ 0.5)，25 ℃振荡提取3 h，3 800 r/min离心10 min，收集上清液。残留物用25 mL 70%丙酮在25 ℃再提取3 h，离心，收集上清液合并，4 ℃保存备用。

1.2.3.2 总酚含量测定

采用福林酚法测定，参考Xu等[12]的方法略有改动。

取0.3 mL提取液，使其与1 mL Folin-Ciocalteu试剂反应，混匀，加入3 mL 10% Na2CO3，加蒸馏水至10 mL，室温静置2 h，在765 nm处测定吸光值。没食子酸浓度与A765nm之间具有高度显著的线性关系，线性方程为y=122.77x-0.003，决定系数R2=0.996 1。总酚含量以每g干物质含量表示。

1.2.3.3 总黄酮含量测定

总黄酮含量采用比色法测定，参考Xu等[12]的方法略有改动。配制浓度为0.356 mg/mL的芦丁标准溶液，备用。取2.0 mL提取液，加40%乙醇至5 mL，先加0.3 mL 5%的亚硝酸钠溶液，摇匀，放置6 min；再加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，放置6 min；最后加入4 mL 1mol/L氢氧化钠溶液，用40%乙醇定容至10 mL，摇匀，放置15 min，于510 nm处测定吸光度。芦丁浓度x与吸光值y之间具有高度显著的线性关系，线性方程为y=11.594x-0.000 3，决定系数R2=0.999 5。总黄酮含量以每g干物质含量表示。

1.2.3.4 花色苷含量测定

参考Jeng等[13]的方法略有改动。取2份豆样提取液3.0 mL，分别用pH为1.0的0.025 mol/L KCl和pH 4.5的0.4 mol/L醋酸钠缓冲溶液定容至10 mL。待平衡1 h后，在530、700 nm处测吸光值，计算花色苷含量。总花色苷含量(以矢车菊素-3-葡萄糖苷计)的计算公式为：

Aλmax=(A530-A700)pH=1.0-(A530-A700)pH=4.5

式中：Aλmax为最大吸收波长处的吸光值；MW为矢车菊-3-葡萄糖苷的分子质量(449.2 g/mol)；DF为待测液稀释倍数；ε为消光系数(29 600 L/mol·cm)；l为光路长度/cm；C为花色苷质量浓度(mg/L)；V为待测液的体积/mL；M为样品质量/g。

1.2.3.5 多糖含量测定

参考GB/T 18672—2002方法提取样品中的多糖，采用苯酚-硫酸法测定。

1.2.3.6 总抗氧化能力测定

采用FRAP法测定，参考Xu等[12]的方法略有改动。FRAP工作液现用现配，将300 mmol/L pH3.6乙酸钠缓冲液、10 mmol/L的TPTZ溶液(用40 mmol/L的HCl溶液配制)、20 mmol/L FeCl3·6H2O溶液按10∶1∶1比例混合得到。FRAP工作液5 mL，再加入50 μL试样或蒸馏水，37 ℃水浴30 min，于593 nm处测定吸光值。以FeSO4·7H2O标准溶液代替样品绘制标准曲线，样品总抗氧化能力以FeSO4·7H2O当量计算。并以FeSO4·7H2O标准溶液代替样品绘制标准曲线，FeSO4·7H2O浓度x与吸光值y之间具有高度显著的线性关系，线性关系为y=0.000 2x-0.015 7，决定系数R2=0.997 1。

1.2.3.7 DPPH·清除率测定

参考Xu等[12]的方法略有改动。取提取液0.5 mL，加入2 mL ，2×10-4mol/L DPPH，和2.5 mL甲醇，充分混合，避光静置30 min，517 nm测定其吸光度A1。同时测定2 mL 2×10-4mol/L DPPH·溶液与3 mL无水甲醇混合液的吸光度A2，以及0.5 mL测定液与4.5 mL无水甲醇混合液的吸光度A0，根据公式计算提取液对DPPH·的清除率：

式中：A0为提取液的本底吸光度；A1为加提取液后的吸光度；A2为未加提取液的吸光度。

1.2.3.8 ABTS+·清除率测定

取测定液0.2 mL，加入5 mL ABTS工作液，充分混合，室温下反应10 min，于734 nm测定其吸光度A1。以无水乙醇代替测定液、ABTS工作液做空白、对照。根据公式计算测定液对ABTS+·的清除率：

式中：A0为未加ABTS工作液、提取液的本底吸光度；A1为加提取液后的吸光度；A2为未加提取液，ABTS工作液的吸光度。

1.2.3.9 ·OH清除率测定

用水杨酸捕捉羟自由基法测定。参考Li等[14]的方法略有改动。取测定液4 mL，加入2 mL 6 mmol/L的FeSO4，2 mL 8 mmol/L水杨酸，最后加入2 mL 24 mmol/L H2O2启动反应，37 ℃水浴20 min后，在510 nm测定吸光度。以蒸馏水代替H2O2作为空白，蒸馏水代替豆样提取液作为对照。

1.2.4 超氧化物歧化酶(SOD)与过氧化物酶(POD)活性测定

称取300 mg豆样，按每0.1 g鲜样加l mL 0.1 mol/L(pH 7.8)磷酸缓冲液的比例于预冷研钵中研磨成匀浆(冰浴中进行)，匀浆在冰冻离心机中(4 ℃)12 000 r/min离心20 min，取上清液置冰箱备用。

1.2.4.1 SOD活性测定

用邻苯三酚发生自氧化法测定[15]。

式中：n为样品稀释倍数；V1为反应液总体积/mL；V2为测定样品体积，mL；M为样品鲜重。

1.2.4.2 POD活性测定

用愈创木酚法测定[16]。

1.2.5 胰蛋白酶抑制剂活性测定

采用赵伟伟[17]方法测定胰蛋白酶抑制剂活性。

2 结果分析

2.1 焙炒对小粒黑大豆抗氧化活性与生理活性的影响

2.1.1 焙炒对小粒黑大豆抗氧化物质的影响

焙炒处理对小粒黑大豆抗氧化物质有影响(表1)。焙炒后的小粒黑大豆的总酚、总黄酮及花色苷含量均显著低于未处理。在210 ℃焙炒50 min，小粒黑大豆的总酚含量与未处理相当，但其总黄酮及花色苷含量显著降低，分别保留了66.85%和7.80%。研究报道干热熟化过程中，维生素以及一些不稳定的抗氧化物质，例如花色苷及黄酮在高温下发生分解，从而降低其抗氧化性[18,19]。Shahidi[20]报道大豆的酚类物质主要由酚酸组成，绿原酸、阿魏酸，咖啡酸是大豆的主要酚酸，具有很强的抗氧化性。Dewanto等[21]研究发现热加工会使一些可溶性酚类物质被释放，从而增强了物质的抗氧化活性。焙炒后小粒黑大豆的多糖含量显著高于未处理，在210 ℃焙炒50 min，其多糖含量最高(28.36 g/100 g)。何喜珍等[22]研究发现，大豆多糖具有一定的抗氧化活性，且抗氧化活性与多糖浓度呈正相关。

表1 焙炒对小粒黑大豆总酚、总黄酮、花色苷及多糖含量的影响

注：表中数值为平均数±标准差(n=3)，同一列中不同字母表示有显著性差异(P<0.05)，下同。

2.1.2 焙炒对小粒黑大豆抗氧化活性的影响

焙炒后，小粒黑大豆的总抗氧化能力和对DPPH·的清除能力显著降低，在150 ℃焙炒80 min最低(表2)。焙炒的小粒黑大豆对ABTS+·的清除能力与未处理相当，其·OH清除率较未处理显著升高，且处理间没有显著差异。Jin等[23]对高蛋白大豆“Saedanbaek”品种在160、180、200 ℃烘焙10 min，其DPPH·清除率分别为54.80、60.39、72.14%，与本研究呈现类似的规律； Boateng等[24]发现经过烘焙处理后的黑豆，其DPPH·清除能力高于未处理黑豆，这可能是由于黑豆品种间差异导致抗氧化能力呈现出不同的规律。植物多酚酚羟基中的邻位酚羟基极易供氢，对氧自由基具有较强的捕捉能力，表现出较强的羟自由基清除能力，总酚含量与羟自由基清除能力成显著正相关[25]，表明总酚含量越高，·OH清除率越高。

表2 焙炒对小粒黑大豆总抗氧化能力、清除自由基能力的影响

2.1.3 焙炒对小粒黑大豆生理活性物质的影响

小粒黑大豆经过焙炒后，其SOD和POD完全失活，胰蛋白酶抑制剂活性显著降低，在210 ℃焙炒50 min，其活性降低了99.27%。

表3 焙炒对小粒黑大豆SOD与POD活性及胰蛋白酶抑制剂活性的影响

2.2 焙炒对黑豆皮抗氧化活性的影响

2.2.1 焙炒对黑豆皮抗氧化物质含量的影响

由表4可以看出，黑豆皮经焙炒处理后，总酚、总黄酮及花色苷的含量均显著低于未处理，在150 ℃ 25 min的处理其抗氧化物质含量最低，较原样分别降低了32.41%、25.35%和37.82%。焙炒处理会明显降低黑豆皮的抗氧化物质含量，但与小粒黑大豆相比，其下降幅度较小。

不同处理黑豆皮多糖含量有显著差异(表4)。110 ℃焙炒35 min时的黑豆皮多糖含量显著低于未处理黑豆皮(23.65%)，150 ℃焙炒25 min的黑豆皮中多糖含量明显高于110 ℃焙炒35 min的处理。李红等[26]报道黑豆皮的主要成分是纤维素，这与米糠的成分类似；周麟依等[27]研究发现米糠经140 ℃高温处理后，米糠中可溶性膳食纤维含量会显著提高，同时高温作用促使米糠中的淀粉降解成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖及麦芽糊精等低分子糖类，导致低分子糖含量增加。

表4 焙炒对黑豆皮中总酚、总黄酮、花色苷及多糖含量的影响

2.2.2 焙炒对黑豆皮抗氧化活性的影响

焙炒条件对黑豆皮抗氧化活性有显著影响(表5)。黑豆皮经焙炒处理后，其总抗氧化能力、ABTS+·清除率和·OH清除率显著低于未处理，在150 ℃焙炒25 min时最低。焙炒后的黑豆皮对DPPH·的清除能力略高于未处理，但不同处理间没有显著差异。阿拉西等[25]认为黑豆皮的总酚含量减少，其清除·OH的能力也相对较弱，即清除·OH的能力大小与提取物总酚含量高低相一致。但是DPPH·清除能力与总酚含量没有类似关系，DPPH·清除能力可能与黑豆皮中的抗氧化活性成分的暴露程度有关，焙炒可能引起相关清除因子的释放，提高了其利用度。

表5 焙炒对黑豆皮总抗氧化能力、清除自由基能力的影响

3 结论

焙炒对小粒黑大豆、黑豆皮的抗氧化组分、抗氧化特性以及生物特性有显著影响。焙炒会导致小粒黑大豆的总酚、总黄酮及花色苷含量以及总抗氧化能力显著降低，SOD、POD及胰蛋白酶抑制剂失活。与210 ℃、50 min焙炒条件相比，在150 ℃下焙炒80 min，小粒黑大豆的总酚、总黄酮、花色苷及总抗氧化能力有较高保留，ABTS+·清除率、·OH清除率较高，多糖含量显著高于原样；其次，210 ℃焙炒的黑豆有焦糊味，会产生对人体有害的美拉德反应产物，且高温焙炒也会提高加工成本。因此小粒黑大豆在150 ℃焙炒80 min可较好地保留抗氧化性。经焙炒处理，黑豆皮的总酚、总黄酮及花色苷含量以及总抗氧化能力显著降低。相比150 ℃焙炒25 min，黑豆皮在110 ℃下焙炒35 min，其总酚、总黄酮和花色苷均有较高保留，其总抗氧化能力、ABTS+·清除率、·OH清除率和DPPH·清除率均较强，多糖含量保留了64.14%，同时胰蛋白酶抑制剂几乎完全失活。因此黑豆皮在110 ℃焙炒35 min可较好保留抗氧化性。