透射电镜下观察白藜芦醇对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡的影响*

1.安徽医学高等专科学校； 2.安徽医科大学，安徽 合肥 230601

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、破坏性的自身免疫性关节疾病[1]，它的病因和发病机制未明确，以成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)异常增殖为主要的病理特征，进而侵蚀和破坏软骨组织，引起关节僵硬畸形及功能障碍，甚至残疾。大鼠佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)模型是为RA研究提供的一种免疫性炎症动物模型，是目前筛选和研究治疗 RA药物的较理想模型[2]。这类动物模型具有简单、实用、可靠等特点。白藜芦醇( resveratrol，RES )是一种天然非黄酮类多酚化合物，分子式C14H12O3,存在于葡萄、决明等植物中。 RES具有抗增殖及调节免疫的作用，为抗风湿治疗提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1AA模型大鼠建模与滑膜细胞的培养 SD雄性大鼠30只，180～200 g，随机分为正常对照组(10只)和AA模型组(20只)，模型组大鼠左后足趾皮内注射0.1 mL弗氏完全佐剂致炎。24 d后，取AA模型建模成功的大鼠踝关节关节囊的滑膜层组织，将脂肪和纤维剔除，按照先前实验方法采用组织块移植培养法培养滑膜细胞，传代3～5代后选择生长状态良好，致密单层的细胞,消化后冻存于含血清的10%DMSO的培养液中,再置于-80℃保存或转至液氮瓶中贮存[3]。

1.1.2滑膜细胞的鉴定 采用兔抗大鼠血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)多克隆抗体荧光鉴定，荧光倒置显微镜下可见滑膜细胞的生长状况良好，滑膜细胞呈梭形，细胞核位于细胞中央，呈卵圆形。

1.2 方法

收集对数生长期的正常组和AA模型组滑膜细胞，以1.0×107/L的密度接种于6孔板中，每孔100 μL，在AA模型组加入不同浓度的RES 100 μL，RES的最终药物浓度分别为0、1、5、20、50 μmol/L，在正常组和AA模型组每孔再加入100 μL 20%胎牛血清的DMEM培养液，在37℃、5%CO2培养箱中培养48 h。制作电镜标本:取出6孔培养板，轻轻拍打，将贴壁生长的FLS细胞落入培养板中，将培养板中的细胞移入锥形离心管中，以800 r/min的速度离心8～10 min，再用吸管沿管壁轻轻地吸除上清液；将离心管中的细胞团移入小瓶中，用PBS漂洗2次，每次15 min，再用浓度为3%戊二醛溶液固定，4℃下过夜，吸出固定剂，再用PBS漂洗3次，每次10 min，用1%四氧化锇在4℃下固定30 min，接着用PBS漂洗3次；运用系列丙酮在温室下脱水，丙酮溶液浓度逐渐升高，浓度依次为：50%、70%、90%、100%，脱水的次数与时间依次为：1次10 min； 1次10 min； 2次，每次10 min；最后3次，每次10 min；吸出瓶中的脱水剂，等体积比加入稀释的包埋剂，30 min后，弃除稀释的包埋剂，加入纯包埋剂，室温放置2 h；把细胞团块移入底部滴加混合包埋剂的胶囊模块中，注满包埋剂，放烤箱60℃烘烤2 h，使其固化并用超薄切片机切取70 nm厚度的超级切片； 将其放于干净培养皿中的牙科石蜡片上滴加柠檬酸铅染色液，让有切片的一面朝下并使载网浮在液滴上，盖上培养皿染色5～30 min，立即用双蒸水清洗3次。吸去多余水分，置培养皿内自然干燥。再以同样方法将载网放在另一只备有蜡片的培养皿中进行柠檬酸铅的染色及清洗。晾干后待观察；用日本JEOL-1230透射电子显微镜观察并拍照。

2 结 果

正常的大鼠细胞有MLS和FLS两型滑膜细胞，其中以MLS为主，透射电镜下观察MLS主要特征：高尔基复合体很发达，核染色质相对致密，大部分看不到核仁，细胞表面许多细长突起向细胞间质突出，细胞之内散在分布多种囊泡和小泡。FLS主要特征：细胞质中缺乏高尔基复合体、囊泡及小泡，而粗面内质网和游离核糖体丰富，细胞核染色质比较疏松呈现细颗粒分布在细胞核的周围。AA大鼠模型组多见FLS，细胞质内线粒体肿胀、嵴被破坏，粗面内质网呈现脱颗粒现象，MLS数量减少。给予RES的AA大鼠给药组也以FLS为主，粗面内质网的数量减少，但是略有扩张，线粒体肿胀减轻，以高浓度RES(50 μmol/L)改善最明显，部分滑膜细胞呈现出明显的凋亡形态学改变，细胞染色质浓缩、边聚、核固缩，形成凋亡小体，断裂的染色质形成粗细不等颗粒分散在细胞质中。见图1。

A.正常MLS(×12000)，细胞质内可见较多的小泡和囊泡；B.正常FLS(×12000)，细胞质内可见丰富的游离核糖体和粗面内质网；C.AA模型大鼠滑膜细胞(×12000)，线粒体肿胀、嵴突破坏；D.白藜芦醇(50 μmol/L)处理组(×12000)，可见线粒体肿胀减退，囊泡恢复明显。
图1 大鼠滑膜组织电镜检查

3 讨 论

滑膜细胞是关节滑膜层的最大细胞群体，关节滑膜细胞根据形态学的差异可分为巨噬细胞样滑膜细胞(macrophage-like synoviocyte，MLS)和成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte，FLS)，即为通常所说的A型和B型滑膜细胞[4]。类风湿关节炎(arthritis， RA)中关节损伤的最终效应细胞即A、B型细胞，A型细胞内的线粒体为细胞的代谢提供能量，高尔基复合体参与分泌活动；B型细胞内的粗面内质网具有分泌蛋白质的功能[5]。RA中炎症发生致使滑膜细胞增殖和血管新生，将体外培养成功的AA大鼠模型踝关节滑膜细胞采用透射电镜观察细胞功能变化，比较正常的滑膜细胞后发现模型组滑膜细胞中具有分泌能力的高尔基复合体数量有所增加，加入不同浓度的RES治疗组发现滑膜细胞中的高尔基复合体、粗面内质网、线粒体和囊泡的数量却有所减少，表明RES能降低亢进的滑膜细胞功能，降低滑膜细胞的变性，继而保护滑膜细胞细胞器的结构。细胞凋亡时以线粒体的改变较为敏感，在细胞凋亡的早期，线粒体肿大、嵴增多、随之线粒体空泡化。加入RES浓度为20、50 μmol/L时，培养的滑膜细胞部分线粒体出现肿胀、嵴增多、空泡化，提示RES可以促进滑膜细胞的凋亡，RES通过降低AA大鼠滑膜细胞具有分泌功能细胞器的数量和功能从而减轻继发性炎症，使其可能具有治疗AA的作用。RES为50 μmol/L时，可见滑膜细胞中的染色质浓缩、边聚、核固缩，核碎片形成，提示高浓度的RES对于AA大鼠却具有促进滑膜细胞凋亡的作用。