不同方法测定舒脑欣滴丸中藁本内酯含量的比较*

山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东 泰安 271016

舒脑欣滴丸由川芎和当归两味药材提取加工制成，具有理气活血、化瘀止痛的功效[1]。临床上常用于治疗血虚血淤引起的头痛、头晕、偏头痛、视物昏花、健忘及失眠等症状，疗效较为显著[2]。而藁本内酯是其主要活性成分之一，药理研究表明，藁本内酯具有保护脑神经、改善微循环、舒张血管、抑制血管平滑肌细胞增殖、抗癌、抗微生物、解热、镇痛消炎等药理作用[3]。目前，藁本内酯的含量测定方法多采用高效液相色谱法[4-6]，因藁本内酯为挥发油成分，也有气相色谱法测定。本次实验建立了舒脑欣滴丸藁本内酯的液相测定方法和气相测定方法，比较不同测定方法对舒脑欣滴丸中藁本内酯含量测定结果的影响。

1 仪器与试药

1.1 仪器

GC-2014C气相色谱仪(日本岛津仪器有限公司)；HV-3静音无油空压机(济南浩伟实验仪器有限公司)；纯水氢气发生器(济南浩伟实验仪器有限公司)；Waters e2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；2998 PDA Detector紫外检测器；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；FR224CN型电子天平(奥豪斯仪器上海有限公司)。

1.2 试药

舒脑欣滴丸(天津中新药业集团股份有限公司，批号：676018)；藁本内酯标准品(实验室自制)；微孔滤膜(孔径0.45 μm)；甲醇(色谱纯，天津市凯通化学试剂有限公司)；乙酸(分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司)；纯净水。

2 方法与结果

2.1 GC法测定

2.1.1色谱条件 GC-2014C气相色谱仪，色谱柱：KB-624毛细管柱(30 m×0.32 mm×1.80 mm)，检测器：氢焰离子化检测器(FID)，进样口温度220℃，检测器温度320℃，色谱柱温度220℃，载气为氮气，进样量为1 μL。

2.1.2对照品溶液的制备 精密称量藁本内酯对照品5.6 mg于25 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，摇匀，制成浓度为200 μg·mL-1的藁本内酯溶液，避光冷保存。

2.1.3供试品溶液的制备 取舒脑欣滴丸5粒，粉碎，精密称重，置具塞锥形瓶中，精密加入70%的甲醇10 mL，称量，超声处理30 min，冷却，再次称定其重量，用甲醇补足失重，0.45 μm微膜滤过，精密量取其续滤液1 mL置于10 mL容量瓶中，加入70%甲醇稀释至刻度，晃匀，即得。

2.1.4系统适用性实验 分别取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液，按上述色谱条件进样分析，记录色谱图，见图1。从色谱图中可以看出，对照品溶液中藁本内酯的保留时间为8.6 min。供试品溶液主峰的保留时间与对照品溶液的主峰保留时间一致，与相邻组分分离较好，无相互干扰。

1—藁本内酯

2.1.5线性关系考察 精密量取藁本内酯对照品母液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置10 ml棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，晃匀，得一系列不同浓度的藁本内酯对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样3次，取平均值，以峰面积对浓度作线性回归，得回归方程为：Y=302.7X+392.4，r=0.9993，结果表明，藁本内酯在10～50 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.1.6精密度和稳定性考察 取对照品溶液按“2.1.1”项下色谱条件，进样量为1 μL，重复进样5次，记录色谱图，以藁本内酯的峰面积计算藁本内酯的RSD为1.74%，表明该方法的精密度良好。

取供试品溶液分别于0，2，4，6，8，10 h按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，以藁本内酯的峰面积计算RSD为0.50%，表明供试品溶液在10 h内稳定性良好。

2.1.7重复性考察 取同一批号舒脑欣滴丸5份，按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液5份，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，计算藁本内酯的峰面积RSD为1.86%，表明重复性良好。

2.1.8加样回收率试验 精密量取“2.1.3”项下已知浓度的供试品溶液6份，各加入对照品适量，用甲醇溶液稀释至刻度，晃匀，按上述色谱条件进样1 μL，每份进样3次，以藁本内酯峰面积计算藁本内酯的平均回收率为101.32%，RSD为1.29%。

2.1.9样品含量测定 取3个不同批次的舒脑欣滴丸样品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，并按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定，计算舒脑欣滴丸中藁本内酯平均含量为876.70 μg/丸。

2.2 HPLC法测定

2.2.1色谱条件 Waters e2695高效液相色谱仪，2998 PDA Detector紫外检测器，Venusil MP C18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，流动相为甲醇-0.2%冰醋酸水溶液(75∶25)，检测波长为325 nm流速为1.0 mL/min，进样量10 μL，柱温30℃。

2.2.2对照品溶液制备 取制备的藁本内酯标准品2.5 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀后即制成浓度为100 μg/mL的标准品贮备溶液，避光冷藏保存。

2.2.3供试品溶液制备 取“2.1.3”项下供试品溶液即得。

2.2.4系统适用性考察 分别取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样10 μL测定。色谱图如图2所示，从图中可以看出藁本内酯在9.9 min出峰，色谱峰峰型良好，且各组分之间互不干扰测定。

a.空白溶液；b.对照品溶液；c.供试品溶液。

2.2.5线性关系考察 精密量取对照品溶液适量，置10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度，制成5、10、20、40、50 μg·mL-1的5个不同浓度，取系列不同对照品溶液10 μL按“2.2.1”项下色谱条件分别进样，记录色谱图，以藁本内酯的峰面积对其浓度进行线性回归，得回归方程为：Y=19525X+55814(r=0.9997)，表明藁本内酯标准品浓度在5～50 μg·mL-1范围内与峰面积线性关系良好。

2.2.6精密度和稳定性考察 取制备好的供试品溶液5份，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积，并计算RSD值，结果藁本内酯RSD为1.04%，表明该方法精密度良好。

取“2.2.3”项下供试品溶液，分别于0、2、4、8、10 h进样测定，按上述色谱条件进样10 μL测定，并计算藁本内酯的RSD为1.25%，表明样品溶液在10 h内稳定。

2.2.7重复性考察 取同一批次的舒脑欣滴丸药品5份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液5份，在“2.2.1”项下色谱条件下进样10 μL，记录下峰面积，并计算RSD值为1.53%，表明该法重复性良好。

2.2.8加样回收率考察 取已知含量的供试品溶液3 mL，6份，置10 mL容量瓶中，分别加入对照品50 μg，用甲醇稀释至刻度，晃匀，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，代入标准曲线计算藁本内酯含量，算出平均回收率为99.7%，RSD为0.6%。

2.2.9含量测定 按“2.2.3”项条件下制备供试品溶液3份，每份各进样3次，记录色谱图，求得舒脑欣滴丸中藁本内酯的含量为887.16 μg/丸。

2.3 F检验

照上述供试品溶液制备方法制备舒脑欣滴丸样品溶液5份，各吸取1 μL按“2.1.1”项下色谱条件测定，各吸取10 μL按“2.2.1”项下色谱条件测定，统计各方法测定项下藁本内酯峰面积，计算含量，利用F检验分析两组数据之间的差异性，判断其差异有无统计学意义。

查阅可知F=S12/S22(S1>S2)，用实验测得的两种含量数据方差代入F检验公式中，计算方差比：F=2.99。F

3 讨 论

本次实验建立了气相色谱法测定舒脑欣滴丸中藁本内酯含量，对气相色谱条件进行优化，考察了检测器温度250℃、280℃、320℃，色谱柱温度200℃、210℃、220℃，结果发现温度对蒿本内酯影响很大，提高检测器温度和色谱柱温度，藁本内酯峰与相邻组分分离较好，达到基线分离，而且出峰时间适中，峰型良好；随着温度的升高，色谱峰会有所提前，节省了实验时间，故检测器温度是320℃，色谱柱温度220℃。同时也建立了高效液相色谱法测定藁本内酯含量，查阅文献进行了流动相优化，考察了0.1%、0.2%、1%冰醋酸溶液，同时也对流动相的比例进行了调整，适当的提高了有机相比例，使其出峰快速，节省实验时间，并且根据分离效果、峰形效果，最终选择甲醇︰0.2%冰醋酸水溶液(75︰25)。

利用F检验对两种方法测定的含量结果进行了检验，其结果并无显著性差异，表明两种方法均可作为舒脑欣滴丸中藁本内酯含量测定的方法，均能准确地测定出其含量，但液相在实际操作过程中较之气相分析时间稍长。