人食管鳞癌p75NTR的核阳性表达细胞特性的研究

王文强，陈雅琳，朱兵兵，慕晓玲

(石河子大学医学院/新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，新疆 石河子 832000)

“肿瘤干细胞”理论在肿瘤学领域引起了越来越多的关注[1-2]。根据这一理论，肿瘤干细胞只占肿瘤细胞的一小部分，但其具有正常干细胞典型的生物学特性，并在一定刺激下能够产生具有高度增殖能力的子细胞[3]。许多临床研究发现，通过靶向治疗技术抑制或消灭肿瘤干细胞的活性和增殖是肿瘤治疗的良好替代方案[4]。肿瘤干细胞的分离和鉴定，对肿瘤的临床诊断和治疗具有重要意义，也是研究食管癌靶向治疗的重要途径[5]。第一个关于食管癌干细胞的报告是在3个食管鳞状细胞癌(ESCC)系中发现SP细胞[6]。p75NTR也称为CD271，是正常食管上皮细胞的干细胞标志物，在食管癌细胞中，与p75NTR阴性表达的癌细胞相比，p75NTR阳性表达的癌细胞被认为具有更高的自我更新和增殖能力，癌细胞的生存和维持也依赖于p75NTR的表达[7]。此外，人们发现p75NTR阳性表达的细胞中干细胞相关基因表达增强，这表明p75NTR不仅与肿瘤转化相关还是干细胞标志物[8]。

本课题组黄艳艳[9]、李秋实[10]等，通过无血清培养法获得了食管癌Eca109细胞球，观察了其干细胞特性及p75NTR表达情况，并进行了增殖和侵袭能力的研究，发现第1代、3代、5代细胞球细胞中p75NTR核阳性表达的细胞数量随球细胞代数的增长依次递增，增殖、侵袭能力都随之相应增强；第5代以后的细胞球的p75NTR表达均为核阳性，而增殖、侵袭能力均未见显著差异。推测p75NTR核阳性表达的球细胞可能是食管癌干细胞。

本研究首先分析病人组织细胞p75NTR的表达，然后分析了p75NTR的核阳性表达与各种预后因子的相关性，探讨干细胞在食管癌病人预后中所起到的作用。最后分析了人食管癌Eca109细胞中分离培养出不同代次的细胞球细胞的细胞周期和成瘤能力，进一步证实细胞球细胞是癌干细胞以及p75NTR核阳性表达的球细胞是食管癌干细胞。

1 材料与方法

1.1 材料

人食管鳞癌细胞系Eca109细胞(中国科学院上海细胞库)；人食管SHEE细胞(新疆医科大学人体解剖与组织胚胎学教研室)；人食管鳞癌组织芯片(2008年至2012年，新疆伊犁友谊医院，共71例，男性48例，女性23例；其中低分化12例，中分化33例，高分化23例)；DMEM/F12无血清培养基、高糖DMEM培养基、胎牛血清和含EDTA的胰酶(Gbico公司)；不含EDTA的胰酶(Solarbio公司)；B27(Invitrogen公司)；兔抗人p75NTR单克隆抗体(Abcom公司)；兔抗人Ki67单克隆抗体(Abcom公司)；山羊抗兔IgG抗体(中杉金桥生物技术有限公司)；细胞周期试剂盒(联科生物公司)；BALB/c裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)。

1.2 方法

选取对数生长期的食管癌Eca109细胞用于实验，细胞用含10%胎牛血清的H-DMEM培养基培养，在37 ℃、5%CO2培养箱内培养。显微镜下观察细胞密度达80%以上时，即可传代。

1.2.1 准备细胞

选用添加过B27(1∶50)的无血清培养基 DMEM/F12和对数生长期的食管癌Eca109细胞，消化、离心，加入无血清DMEM/F12培养基稀释成1×105/mL的单细胞悬液种入培养瓶中，37 ℃，5% CO2培养箱中培养，待食管癌Eca109细胞形成连接紧密、体积较大的悬浮的细胞球时，再次进行传代，获得实验所需代次细胞球细胞。

1.2.2 免疫组织化学技术检测人食管鳞癌切片中p75NTR的表达

将组织进行石蜡包埋和切片。组织切片放入60 ℃左右的烤箱中烘烤2 h，然后依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ、无水乙醇、95%酒精、80%酒精、70%酒精中，每个试剂中大概5 min；自来水冲洗后，使用枸橼酸进行高压修复8 min；冷却至室温，再次使用自来水冲洗，放入3%甲醇双氧水溶液中，浸泡10 min；然后用PBS冲洗3遍，进行滴加一抗(p75NTR和Ki67浓度均为1∶200)4 ℃孵育过夜。次日，37 ℃复温 30 min，滴加山羊抗兔IgG二抗室温孵育30 min；PBS冲洗后DAB显色，然后进行苏木素复染和酸酒精酸化；最后放入70%酒精、80%酒精、95%酒精、无水乙醇、二甲苯Ⅲ、二甲苯Ⅱ和二甲苯Ⅰ的染色缸中各5 min。采用普通光学显微镜来观察着色部位及分布。

1.2.3 细胞周期检测

将对数生长期的细胞进行消化、离心，稀释成1×106/管。PBS冲洗后，缓慢加入预冷的75%乙醇，避光4 ℃过夜。次日，预冷PBS冲洗后，分别加入100 μL溴化乙锭(PI)和10 μL RNaseA混匀，室温避光孵育30 min。然后使用流式细胞仪进行检测。

1.2.4 裸鼠成瘤

将对数生长期的细胞进行消化、离心，使用不含血清的DMEM稀释成需要的浓度(3×106/150 μL、1×106/150 μL、5×105/150 μL)。然后将150 μL细胞注入5周的BALB/c裸鼠右腹股沟皮下处，左腹股沟皮下注射生理盐水作为对照。在SPF动物房饲养14 d后处死，观察裸鼠右腹股沟皮下肿瘤生长情况并与左腹股沟相对比，然后对肿瘤进行称重。

1.2.5 统计学方法

2 结果

2.1 p75NTR在食管癌组织中的表达与各种预后因素的相关性

p75NTR在正常食管组织中主要表达在基底层细胞，且均为浆表达；在食管癌组织中 p75NTR呈散在分布，并且发现除了细胞浆/膜表达的细胞外，有少部分细胞为核表达。Ki67在正常食管组织中也主要表达于基底层细胞；在食管癌组织中阳性表达的细胞散在分布，且阳性表达强度和阳性细胞数量明显高于正常组织(图1)。

将p75NTR在食管癌组织中的表达情况与病人预后因素进行统计学分析(表1)。p75NTR的表达与年龄、肿瘤直径和病理分级有关，而与性别、Ki67的表达和远处转移没有相关性。我们又将p75NTR阳性分为p75NTR浆阳性和p75NTR核阳性，并与预后相关因素进行分析，发现p75NTR核阳性表达与肿瘤直径和病理分级有关，而与年龄、性别等预后因素无关(表2)。

图1 p75NTR和Ki67在正常食管组织和食管癌组织中的表达Fig.1 p75NTR and Ki67 were expressed in normal esophageal tissue and esophageal carcinoma

预后因素食管鳞状细胞癌p75NTR阳性p75NTR阴性tP总和2942年龄55.43±2.46765.5±3.2512.4270.0208性别男17/29(58.62%)31/42(73.81%)1.80710.1789女12/29(41.38%)11/42(26.19%)肿瘤直径(cm)3.33±0.38196.5±1.9363.3460.0388Ki67表达情况高20/29(68.97%)25/42(59.52%)0.658910.4169低9/29(31.03%)17/42(40.48%)∗远处转移6/29(68.97%)12/42(28.57%)0.563110.4530病理分级低分化3(10.34%)9(21.43%)9.97820.0068中分化20(68.97%)13(30.95%)高分化6(20.69%)17(40.48%)

注：*远处转移包括淋巴结转移、肝转移、肺转移和肠道转移等。

表2 p75NTR核表达与预后因素之间的关系Tab.2 Correlation between nuclear expression of p75NTR and prognostic factors

注：*远处转移包括淋巴结转移、肝转移、肺转移和肠道转移等。

2.2 不同代次细胞球的细胞周期

不同代次细胞球的细胞周期见图2。

采用流式细胞仪检测食管癌Eca109细胞和不同代次细胞球细胞的细胞周期，发现处于G0/G1期中的细胞比例在Eca109细胞、第3代和第5代细胞球细胞中依次递增(P<0.05)，在第5代、第7代和第9代细胞球细胞中没有显著差异(P>0.05)(图2)。

A: 食管癌Eca109细胞；B：第3代细胞球细胞；C：第5代细胞球细胞；D：第7代细胞球细胞； E：第9代细胞球细胞；F: Eca109细胞和不同代次细胞球细胞的细胞周期统计图图2 细胞周期分析Eca109细胞和不同代次细胞球细胞Fig.2 Cell cycle analysis of Eca109 cells and pellets of different generations

2.3 不同代次细胞球细胞的致瘤能力

课题组前期实验可以看出，第5代以后的细胞球细胞在增殖和侵袭能力并未发生明显改变。所以我们选用食管癌Eca109细胞、第3代(Q3)和第5代(Q5)细胞球细胞进行实验，并使用SHEE细胞和

生理盐水进行对照。在3×106浓度组中，除SHEE细胞成瘤率为33.3%(1/3)外，其他细胞成瘤率均为100%(3/3)；在1×106和5×105浓度组中，SHEE细胞均未成瘤(0/3)，其他细胞均100%成瘤(3/3)(图3、表3)。

图3 不同代次细胞球细胞的致瘤能力Fig.3 Tumorigenic ability of pellet cells of different generations

表3 不同代次不同细胞浓度细胞球细胞的致瘤率Tab.3 The tumorigenic rate of pellet cells in different generations and concentrations

而且在3组不同浓度组中，Eca109细胞、第三代和第五代细胞球细胞所形成的肿瘤重量依次递增，具有统计学意义(P<0.05)(图4)。

将肿瘤进行包埋、免疫组织化学染色，在Eca109细胞、第3代和第5代细胞球细胞形成的肿瘤中，p75NTR阳性的细胞(箭头所指)所占百分比依次增多，Ki67阳性的细胞所占百分比依次减少，而p75NTR核阳性的细胞(蓝色箭头)只有在第5代细胞球细胞形成的肿瘤组织中存在(图5)。

图4 不同代次细胞球细胞在不同细胞浓度下形成肿瘤的重量Fig.4 The weight of different generations of pellet cells to form tumors at different cell concentrations

图5 不同代次细胞球细胞在不同细胞浓度下形成肿瘤的免疫组化染色Fig.5 Immunohistochemical staining for the formation of tumor by different generations of pellet cells at different cell concentrations

3 讨论

“肿瘤干细胞理论”得到了越来越多的探讨和研究。最近对食管鳞状细胞癌的研究表明，p75NTR主要表达于未成熟的细胞中，而在食管鳞癌标本中，分化末期的细胞中并未发现p75NTR的表达；而且p75NTR表达阳性的细胞具有肿瘤干细胞的生物学特性，例如克隆形成能力、裸鼠致瘤能力和化疗药物抵抗能力[11-12]。

在对p75NTR的研究中我们发现，p75NTR阳性表达的细胞又可以分为p75NTR浆阳性和核阳性表达两个细胞群落。然而，对p75NTR核表达阳性细胞的研究目前在癌细胞方面未见报道。通过无血清培养基悬浮培养法，我们有效的获得到食管癌干细胞球样细胞[13-14]。李秋实等[10]通过对获得的食管干细胞球样细胞研究发现，第5代以后的细胞球样细胞p75NTR均为核表达阳性，且增殖、侵袭能力明显比食管癌Eca109细胞更强，而且发现食管癌Eca109细胞中p75NTR核阳性表达量非常少。由于目前没有相应的技术手段将p75NTR核阳性细胞和p75NTR阴性细胞进行区分，我们默认为Eca109细胞全为p75NTR阴性表达细胞。基于该假设和研究基础，我们对p75NTR核表达阳性细胞的细胞周期、致瘤能力和与预后因素的相关性进行了进一步研究。

癌细胞相比于正常组织细胞，其最大的特点就是具有恶性增值能力。Ki67可以特异性标记处于增殖期的细胞，免疫组化显示人食管鳞癌组织中Ki67的细胞表达量和表达强度明显高于正常食管组织，表明癌组织中的细胞具有更强的增值能力。进一步分析发现人食管鳞癌组织p75NTR核阳性表达细胞数量与肿瘤直径和病理分级有显著相关性。肿瘤直径是肿瘤细胞增殖能力的直观体现，p75NTR核阳性表达细胞与肿瘤直径的关系表明p75NTR核阳性的细胞可能在一定条件刺激下具有更强的增值能力。我们又将p75NTR核表达阳性细胞分离出来，发现p75NTR核表达阳性细胞主要存在于低分化的肿瘤组织中。有研究表明，低分化的肿瘤在一定刺激下具有更强的增殖、侵袭能力。说明p75NTR核阳性表达的细胞可能具有干细胞的特性。

根据现代干细胞理论，干细胞主要处于细胞分裂时期中的静止期，当受到一定刺激时，会进行大量的分裂和增殖[15-17]。通过细胞周期的研究发现，在食管癌Eca109细胞球细胞中，随着p75NTR核阳性表达量的升高，处于G0/G1期的细胞所占比例随之升高。这表明p75NTR核阳性的细胞在细胞周期方面表现出干细胞的生物学特性。

我们将p75NTR核阳性的细胞和Eca109细胞分别注射入裸鼠皮下，以确定p75NTR核阳性的细胞是不是比不表达p75NTR的细胞具有更强的致瘤能力，结果证明了这个猜想。第5代细胞球(全部为p75NTR核表达阳性的细胞)比Eca109(默认为p75NTR不表达)和第3代细胞球细胞(p75NTR阴性、浆阳性和核阳性细胞均有)具有更强致瘤能力，选用不同的细胞浓度得出了相同的结论。这与前期课题组研究发现p75NTR核阳性的细胞具有更强的增殖和侵袭能力相一致[10]。利用免疫组织化学技术对形成的肿瘤进行染色，发现在p75NTR核阳性细胞所形成的肿瘤中p75NTR的表达量明显高于Eca109细胞，且p75NTR核阳性的细胞只存在于p75NTR核阳性细胞形成的肿瘤组织中。

综上所述，通过细胞球形成实验得到的第5代以后的细胞球细胞为基本纯化的食管癌干细胞，我们的实验结果也证明了这一点。但是在致瘤实验中，p75NTR核阳性细胞球细胞形成的肿瘤中出现了大量的p75NTR表达阴性和浆阳性的细胞，可能是p75NTR核阳性细胞在一定条件下分化产生的。p75NTR是一种通过膜内蛋白水解调节的跨膜受体，具有胞外结构域(Extracellular domain，ECD)、单个跨膜结构域(Transmembrane domain，TM)和胞内结构域(Intracellular domain，ICD)[18-19]。α-分泌酶(α-Secretase)切割p75NTR胞外结构域,剩余的含有跨膜和胞内结构域的C-末端片段(C-terminal fragment，CTF)随后被γ-分泌酶(γ-Secretase)切割，释放胞内结构域(Intracellular domain， ICD)，我们前期的研究发现，食管癌细胞系Eca109可以自分泌神经营养因子(NGF)，并且NGF以γ-分泌酶依赖的方式促进食管癌细胞p75ICD的核转移[20]。由此可知，我们检测到核阳性的细胞表达的可能是p75ICD。然而，p75ICD在食管癌干细胞分化过程中扮演什么角色？是由细胞核转移到细胞浆还是在分化过程中不断被消耗？还需要进一步的研究和探讨。