Rab27B和HPV16/18蛋白质在宫颈鳞癌表达的意义

辛慧珍，潘璐彤，齐军，热衣汗古丽·吾不力，陈巧，石敏华， 张静，靳馥源，张春贺，李洪涛，潘泽民*

(1 新疆地方与民族高发病教育部重点实验室/石河子大学医学院生物化学教研室，新疆 石河子 832002； 2 石河子市第一中学, 新疆 石河子 832000；3 石河子大学医学院，新疆 石河子 832002)

宫颈鳞癌是全球妇女中仅次于乳腺癌的常见的恶性肿瘤，是威胁妇女健康，导致妇女死亡的主要恶性肿瘤之一[1]。宫颈鳞癌的发生有多种因素，其中持续性感染高危型人乳头瘤病毒是引起宫颈鳞癌，并发展为侵袭性癌的主要因素[2]。

人乳头瘤病毒是一类感染人类上皮细胞的病毒，其中HPV16和HPV18型是宫颈鳞癌中重要的高危型病毒。这两种高危型HPV是引起宫颈上皮内瘤样病变以及宫颈鳞癌的重要因素，高危型的HPV的致癌蛋白E6和E7可以导致抑癌蛋白P53和pRb失活，引起细胞周期失调，细胞恶性转化[3]。因此，临床检测高危型HPV感染可以作为诊断宫颈鳞癌的重要生物标志物。

Rab蛋白质是小GTP酶家族的成员，同时，作为RAS蛋白家族的成员之一，Rab蛋白质参与细胞的生长、分化, 被激活后就具有致癌性[4]。

目前为止，大约发现70多个含GTP酶的小Rab异构体，其中Rab1-Rab43已经在人类和小鼠中得到鉴定。据相关文献报道，Rab蛋白质在囊泡的形成、运输、融合等过程中发挥着至关重要的作用，而肿瘤的发生发展过程中又不可或缺地伴随着囊泡的这些生理过程[5]。Rab27 A和Rab27B是Rab亚家族的成员，被证实具有71%的同源性[6]。

已有研究证明 Rab27 A、Rab27B与肿瘤转移相关的临床特征关系密切，具体来说，这两种蛋白质所调节的胞吐作用在癌发展过程中起关键作用[7]。

目前关于Rab27B与宫颈鳞癌之间的关系尚未见诸报道，本研究尝试通过免疫组织化学实验分析宫颈鳞癌组织和慢性宫颈炎组织中Rab27B和HPV16/18蛋白质表达水平，为认识宫颈鳞癌的发病原因及发现宫颈鳞癌诊断的分子标志物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 标本收集

研究对象为2012年6月到2014年12月在喀什人民医院和伊犁友谊医院就医的患者，收集宫颈鳞癌患者49例和慢性宫颈炎患者37例连续石蜡标本组织切片用于免疫组织化学实验，病理切片均于4 ℃冰箱保存。

患者中位年龄47岁，最小患者年龄30岁，最大患者年龄72岁。标本组织都经过两位有经验的医师进行诊断，所有患者经书面知情同意参与本研究。

1.2 免疫组织化学实验方法

Rab27B和HPV16/18 E6蛋白质在宫颈组织中的表达采用免疫组织化学实验检测。免疫组化实验中Rab27B抗体稀释和HPV16/18 E6抗体稀释均为1∶200，抗原修复方式是使用pH 6.0的枸橼酸高压修复8 min。

本实验采用免疫组织化学(IHC)Envision法染色两步法，严格按照试剂盒说明书进行操作。用磷酸盐缓冲溶液(PBS)代替一抗作为阴性对照。Rab27B抗体购于中国武汉三鹰生物技术有限公司，Anti-HPV16 E6 + HPV18 E6抗体[C1P5]，购于美国Abcam公司。

实验操作经过烤片、脱蜡、水化、抗原修复、冷却、洗片、孵育一抗、复温、洗片、孵育二抗、洗片、显色、复染及蓝化、脱水及透明过程。

免疫组织化学实验对慢性宫颈炎组织和宫颈鳞癌组织进行HPV16/18 E6蛋白的检测及其Rab27B蛋白质表达水平的检测。

结果判读采用双盲法：由两位病理学专家独立双盲阅片，结果取其平均值。采用阳性细胞所占百分比和细胞染色强度两者乘积来判断阳性强度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 免疫组织化学实验检测慢性宫颈炎和宫颈鳞癌组织HPV16/18 E6的表达

HPV16/18感染通过免疫组织化学实验在慢性宫颈炎组织和宫颈鳞癌组织中进行检测，发现宫颈鳞癌组织中HPV16/18感染高于慢性宫颈炎组织。图1 A显示慢性宫颈炎组织HPV16/18 E6表达为阴性，表明HPV16/18感染阴性，而图1B显示宫颈鳞癌组织感染HPV16/18阳性。

A：慢性宫颈炎组织 B：宫颈鳞癌组织图1 HPV16/18 E6在慢性宫颈炎组织和宫颈鳞癌组织的表达水平(×200)Fig.1 The expression level of HPV16/18 E6 protein in chronic cervicitis tissue and cervical cancer tissue by immunohistochemistry(×200)

2.2 慢性宫颈炎和宫颈鳞癌组织HPV16/18感染分析

通过对37例慢性宫颈炎组织和49例宫颈鳞癌组织HPV16/18免疫组织化学实验分析，发现慢性宫颈炎组织感染率为13.5%，而宫颈鳞癌组织感染率为46.2%，差异有统计学意义(表1)。

2.3 免疫组织化学实验检测Rab27B在慢性宫颈炎和宫颈鳞癌组织中的表达

通过在慢性宫颈炎和宫颈鳞癌组织中，检测Rab27B蛋白质的表达水平，发现慢性宫颈炎组织中Rab27B阴性表达标本数量多，而阳性表达标本数量少。在宫颈鳞癌组织中，Rab27B蛋白表达阴性标本少，而阳性和中、强阳性表达的标本数量多(图2)。

表1 HPV16/18 E6在慢性炎症组织、 宫颈鳞癌组织中的表达Tab.1 The expression level of HPV16/18 E6 in chronic cervicitis tissue and cervical cancer tissue

注： *P<0.05，差异具有统计学意义。

A：慢性宫颈炎组织Rab27B表达阴性； B：宫颈鳞癌组织Rab27B表达弱阳性； C：宫颈鳞癌组织Rab27B表达中强度阳性；D：宫颈鳞癌组织Rab27B表达强阳性图2 Rab27B在慢性宫颈炎组织和宫颈鳞癌组织中的表达水平(×200)Fig.2 The expression level of Rab27B in chronic cervicitis tissue and cervical cancer tissue by immunohistochemistry(×200)

2.4 Rab27B蛋白质在慢性宫颈炎和宫颈鳞癌组织中表达分析

Rab27B蛋白质表达水平在慢性宫颈炎组织中阴性表达占35.1%，中、强阳性表达为32.4%。在宫颈鳞癌组织中阴性表达占12.2%，中、强阳性表达为63.3%。两者比较具有统计学意义(表2)。

表2 Rab27B蛋白质在慢性炎症组织、宫颈鳞癌组织中的表达Tab.2 The expression level of Rab27B in chronic cervicitis tissue and cervical cancer tissue

注：*P<0.05，结果差异具有统计学意义。

2.5 宫颈鳞癌组织中Rab27B和HPV16/18 E6蛋白质的表达相关性分析

通过将宫颈鳞癌组织中Rab27B蛋白质表达水平与HPV16/18 E6关系进行分析，发现49例宫颈鳞癌组织中有24例Rab27B、HPV16/18 E6同时表达阳性，3例Rab27B表达阴性但HPV16/18 E6表达阳性，同时49例宫颈鳞癌组织中有4例Rab27B、HPV16/18 E6同时表达阴性，18例Rab27B表达阳性但HPV16/18 E6表达阴性。表明Rab27B蛋白质表达阳性标本同时出现HPV16/18的感染标本数量多，差异具有统计学意义(表3)。

表3 Rab27B蛋白质和HPV16/18 E6在 宫颈鳞癌组织中的表达Tab.3 The expression level of Rab27B protein in cervical cancer tissue

注：*P<0.05，差异具有统计学意义。

2.6 慢性宫颈炎组织中Rab27B和HPV16/18 E6蛋白质的表达相关性分析(表4)

表4 Rab27B蛋白质和HPV16/18 E6在 慢性宫颈炎组织中的表达Tab.4 The expression level of Rab27B protein in chronic cervicitis tissue

注：*P<0.05，差异具有统计学意义。

通过将慢性宫颈炎组织中Rab27B蛋白质表达水平与HPV16/18 E6关系进行分析，发现37例慢性宫颈炎组织中有2例Rab27B和HPV16/18 E6同时表达阳性，有3例Rab27B表达阴性但HPV16/18 E6表达阳性，同时37例慢性宫颈炎组织中有22例Rab27B表达阳性但HPV16/18 E6表达阴性，10例Rab27B和HPV16/18 E6同时表达阴性。表明慢性宫颈炎组织中Rab27B蛋白质表达阳性标本同时出现HPV16/18的感染数量少，差异具有统计学意义(表4)。

3 讨论

目前，宫颈鳞癌的发病率居高不下，成为女性健康的“第二杀手”。世界范围内，已有充分的证据证明持续性的HPV感染是引发宫颈鳞癌的首要因素。在HPV的诸多亚型中，HPV16和HPV18两种病毒是引起宫颈鳞癌的主要两种病毒，一般HPV16病毒在宫颈鳞癌中感染率为50% 以上，HPV18在宫颈鳞癌感染在20% 左右[8]，也有研究显示，这两种病毒可以共同感染宫颈鳞癌组织，一起发挥致癌作用[9]。

人Rab27B基因定位于人染色体18q21.2，编码218个氨基酸的蛋白质。 在成人组织中，Rab27B在多种分化的分泌上皮细胞中表达，包括乳腺、胃肠道和前列腺分泌上皮细胞等[10]。研究表明， Rab27B促进雌激素受体(ER)阳性乳腺癌细胞系的侵袭性生长和转移，并且表达增加与患者预后不良有关[11]。此外，Rab27B通过调节细胞外基质金属蛋白酶-9(MMP9)的表达和活化，促进胶质瘤侵袭[12]。在肝癌组织中，Rab27B激活MMP2的分泌使肝癌恶性水平增加[13]。Rab27B对人胰腺癌细胞侵袭、增殖、凋亡和化疗耐药也有重要影响[14]。此外，还有大量对Rab27B与胃肠道肿瘤[15]、肺部肿瘤[16]等发生发展的相关关系的研究，都证明Rab27B促进了肿瘤的发生和发展，故其可作为潜在的肿瘤标记物来判断预后，亦可为临床治疗的过程提供参考。然而，对Rab27B与宫颈鳞癌发生与发展的关系却不十分清楚。

基于目前为止对于Rab27B与多种肿瘤迁移、侵袭及转移的关系的研究，我们通过在慢性宫颈炎和宫颈鳞癌组织中检测Rab27B蛋白质表达水平，发现宫颈鳞癌组织中该蛋白质表达水平明显高于慢性宫颈炎组织。特别是宫颈鳞癌组织中等强度阳性和强阳性的表达多于慢性宫颈炎组织，可能提示Rab27B蛋白质表达与宫颈鳞癌的发生和发展相关。检测慢性宫颈炎组织和宫颈鳞癌组织中HPV16/18 E6表达，发现宫颈鳞癌组织中HPV16/18 E6表达量明显高于慢性宫颈炎组织。

通过研究宫颈鳞癌组织中Rab27B与HPV16/18 E6表达的相关关系发现，宫颈鳞癌组织中Rab27B表达量高并且伴随着HPV16/18 E6同时表达。提示Rab27B蛋白质的表达结合HPV16/18的感染可能与宫颈鳞癌的发生与发展相关。然而，通过在慢性宫颈炎组织中对Rab27B和HPV16/18表达水平相关性检测，发现大部分标本Rab27B表达水平较低同时也伴随HPV16/18表达水平低，进而说明Rab27B和HPV16/18在慢性宫颈炎组织表达水平可能相关。

外泌体是细胞分泌的膜囊泡，具有一定的结构和生物化学特征，并能传递侵袭生长信号来调节肿瘤微环境，有研究表明它可能参与细胞间通讯和感染性疾病的发病机制。Honegger等[17]的研究结果提示宫颈癌细胞外泌体与癌细胞增殖和凋亡的调控有关, 从而为早期诊断提供了新的可能性。Rab27B是HPV阳性细胞系HeLa、SiHa关键的外泌体[18-19]，我们的研究在体外初步检测了HPV16/18阳性的宫颈癌组织中Rab27B的表达情况，为其是否参与宫颈鳞癌的发生与发展和进一步研究其作用机制奠定了一定的基础。

4 结论

综上所述，宫颈鳞癌组织中Rab27B蛋白质的异常表达结合HPV16/18蛋白质的表达，可能与宫颈鳞癌的发生与发展相关。