稽留流产患者蜕膜组织辅助性T17细胞、调节性T细胞及其相关细胞因子的表达观察

2019-07-10 07:46王娅萍李敏清覃琴红韦江璇
山东医药 2019年18期
关键词:兔抗人母胎蜕膜

王娅萍,李敏清,覃琴红,韦江璇

(1广西医科大学,南宁530022;2广西医科大学第一附属医院)

稽留流产是指胚胎或胎儿已死亡滞留宫腔未能及时自然排出者,若不能得到及时诊治,会导致母体凝血功能异常、DIC等[1]。稽留流产病因复杂,可能与染色体异常、内分泌异常、感染和免疫因素等[2~5]有关。母体通过一系列免疫调节应答对胚胎产生耐受,母胎的免疫平衡可维持胎儿的正常发育,这个过程与辅助性T(Th)细胞和调节性T(Treg)细胞密切相关[6, 7]。Th17细胞是一类独立的CD4+T细胞亚群,可特异性高分泌白细胞介素(IL-17),介导炎症反应,诱发自身免疫病。Treg细胞是具有免疫调节功能的T细胞,与Th17在功能上互相拮抗,可分泌TGF-β使免疫下调。研究[8]表明,Th17/Treg免疫失衡参与复发性流产等不良妊娠的发生。而在稽留流产患者血清中Treg细胞比例降低[9]。目前关于稽留流产患者蜕膜组织Th17细胞、Treg及其相关细胞因子IL-17、IL-21、IL-10、TGF-β表达相关报道较少。我们观察了稽留流产患者蜕膜组织Th17细胞、Treg细胞及其相关细胞因子IL-17、IL-21、IL-10、TGF-β的表达变化,探讨Th17/Treg免疫失衡在稽留流产发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年9月~2018年6月在广西医科大学第一附属医院计划生育门诊的30例稽留流产患者作为观察组,同期30例正常早孕要求行人工流产手术患者作为对照组,以经阴道彩超和人绒毛膜促性腺激素水平动态监测结果为诊断依据。两组孕妇均为单胎自然受孕,既往无不良孕产史,排除子宫及宫颈病变,夫妇双方染色体正常,排除生殖道感染,排除内分泌代谢紊乱性疾病及自身免疫疾病,男方精液常规检查正常。通过末次月经推算孕周,超声测量胚胎的头臀长以确认,两者相差大于2周者不纳入本研究。观察组年龄22~35(27.43±3.74)岁,孕周6~10(7.57±1.04)周;对照组年龄23~34(27.93±3.32)岁,孕周在6~9(7.70±0.95)周,两组年龄、孕周间差异无统计学意义。两组均行腹部B超引导行负压吸宫术,将宫腔内容物置于0.9%生理盐水中漂洗干净,分离出蜕膜组织,保存备检。本研究已获得我院伦理委员会的批准,患者及其家属均已知情同意。

1.2 试剂与仪器 PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD4、PE Mouse Anti-Human IL-17A、PE Mouse Anti-Human CD25、647 Mouse Anti-Human FoxP3、Human FoxP3 Buffer Set A+B均购自于美国BD公司,兔抗人IL-17抗体、兔抗人IL-21抗体、兔抗人IL-10抗体、兔抗人TGF-β抗体、S-P超敏试剂盒、DAB显色液、过氧化氢溶液由福建迈新生物技术开发有限公司提供,低温高速离心机、流式细胞仪由美国Beckman公司生产。

1.3 蜕膜组织Th17、Treg细胞比例测算 取两组蜕膜组织Percoll细胞分离液分离出淋巴细胞。CD4+IL17+Th17 检测:取淋巴细胞悬液加入800 μL血清培养基和200 μL 的PMA,37 ℃避光孵育4 h,PBS洗涤重悬后加入4 μL的Hu CD4 PerCP-Cy5.5于4 ℃冰箱避光30 min,250 μL破膜剂破膜后4 ℃避光30 min,加入20 μL的 Hu IL-17A PE MAB,4 ℃避光30 min,PBS洗涤重悬后用流式细胞仪检测Th17细胞占CD4+T淋巴细胞的比例。CD4+CD25+Treg 检测:取淋巴细胞悬液加入4 μL 的Hu CD4 PerCP-Cy5.5、20 μL 的PE Mouse Anti-Human CD25混匀,避光孵育30 min,加500 μL的 Hu FOXP3 Buffer,避光20 min,PBS洗涤,加20 μL FOXP3-647避光30 min,PBS洗涤重悬后用流式细胞仪检测Treg细胞占CD4+T淋巴细胞的比例。重复3次,取平均值。

1.4 蜕膜组织IL-17、IL-21、IL-10、TGF-β检测 采用免疫组化法。取两组蜕膜组织取出石蜡切片脱蜡并水化,使用PH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液煮沸,热修复抗原90 s,3%H2O2室温孵育15 min,非免疫血清封闭40 min,加一抗(兔抗人IL-17抗体、IL-21抗体、IL-10抗体、TGF-β抗体工作浓度分别为1∶400、1∶300、1∶5 000、1∶400)4 ℃孵育过夜。加入生物素标记的二抗,室温孵育20 min,室温孵育20分钟,DAB显色5 min,自来水充分洗涤;苏木素复染1 min,水洗反蓝;梯度酒精脱水,二甲苯液透明,中性树胶封片。免疫组化的染色强度用平均光密度(OD)来表示。在×400光学显微镜下,每张切片随机选取5个视野拍照,使用ImagePro Plus6.0软件分析计算图片的OD值,每张切片的OD值为5个视野OD值的平均值,代表相应蛋白的表达量。重复3次,取平均值。

2 结果

观察组、对照组蜕膜组织Th17细胞百分比分别为7.21%±1.30%、5.91%±1.06%,Treg细胞百分比分别为5.75%±1.05%、7.385±1.25%,观察组、对照组蜕膜组织Th17/Treg分别为1.31±0.41、0.82±0.18,两组比较,P均<0.05。观察组、对照组蜕膜组织IL-17相对表达量分别为0.058±0.007、0.047±0.009,IL- 21相对表达量分别为0.030±0.009、0.024±0.006,IL-10相对表达量分别为0.028±0.01)、0.035±0.009,TGF-β相对表达量分别为0.026±0.007、0.038±0.008,两组相比,P均<0.05。

3 讨论

免疫学研究表明,自然妊娠是一种半同种异体移植的过程,母体的蜕膜和胚胎的滋养细胞共同组成母胎界面,免疫细胞间的微环境可维持母胎免疫耐受,对妊娠的正常进行起重要作用[4]。以往对免疫平衡的研究[10]集中在Th1/Th2,Th1主要参与细胞免疫应答,Th2参与体液免疫应答,Th1/Th2是维持正常妊娠的必要条件。近年来有学者[11]认为,Th1/Th2平衡学说无法全面解释母胎免疫耐受机制,遂在此基础上,提出了Th17/Treg 平衡学说。

Th17 细胞是一类独特的Th亚群,可分泌IL-17、IL-21等细胞因子,参与炎症反应和免疫应答,在妊娠早期,其表达下调[12]。IL-17是Th17的主要效应因子,能有效地介导中性粒细胞的动员兴奋过程,从而有效介导组织的炎症反应,其与受体结合后通过MAP 激酶途径及核转录因子途径发挥生物学作用。IL-17作为一种致炎细胞因子,主要由活化的T细胞产生,同时又可以促进T 细胞的激活以及产生更多的促炎因子。IL-17在多种自身免疫疾病的组织和血清中异常性高表达[13],在复发性流产患者蜕膜组织IL-17含量较正常早孕患者高[14]。IL-21是Th17产生的另外一种可维持机体免疫功能的重要细胞因子,其可能通过抵抗Treg细胞诱导的母胎免疫保护作用以及通过对Th17的正反馈调节使母胎免疫耐受形成受阻[15]。CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞为调节性T细胞,包括Tr1、Th3等。Treg细胞的特征性标志为高表达转录因子Foxp3,而后者也是决定其功能的关键基因[16],可促进 Tr1分泌高水平的IL-10和中等水平的TGF-β,从而抑制幼稚型和记忆型T细胞增殖反应,防止自身免疫病的发生,以及促进Th3分泌大量TGF-β,抑制免疫效应细胞的增殖和分化[17]。孕期母体内Treg 细胞表达增加,并在母体免疫细胞到达胎盘滋养层初次接触胎儿抗原时起重要免疫保护作用,当Foxp3表达下降时,可直接影响Treg细胞的数量和功能,进而降低母体对胎儿的免疫耐受,增加免疫排斥,导致病理妊娠[18]。

以往Th17/Treg平衡在不良妊娠的研究多集中在不明原因复发性流产(RSA)及先兆流产,RSA患者外周血及蜕膜组织中Th17占CD4+T细胞的比例高于正常早孕患者,同时Treg 细胞比例降低[19,20],而稽留流产作为不良妊娠的一种特殊类型,其外周血Treg 细胞比例较正常早孕患者低[10]。在本研究中,观察组患者蜕膜组织中Th17细胞比例、Th17/Treg比值、Th17相关细胞因子IL-17、IL-21的表达量均高于正常早孕人流患者,同时Treg细胞比例、IL-10和TGF-β的表达量均低于对照组。这说明在稽留流产的发病过程中,具有促炎作用的Th17 细胞发挥免疫应答作用,上调IL-17、IL-21表达,IL-17可诱导炎症因子聚集于母胎界面[21],而IL-21又对Th17 细胞的表达有促进作用,同时具有免疫抑制功能的Treg 细胞表达降低,Th17/Treg比例失衡导致母胎界面的免疫排斥反应,对胚胎的着床和发育产生不良影响,促进不良妊娠,进而导致稽留流产的发生。

综上所述,在稽留流产患者的蜕膜组织中,Th17细胞及相关细胞因子表达增加,而Treg细胞及相关细胞因子表达降低,Th17/Treg比例失衡在稽留流产的发生发展中起重要作用。但本研究样本例数较少,可能存在一定的偏倚,尚需大样本的实验进一步证实,而Th17/Treg对稽留流产的影响机制也需更深入的研究。

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