超促排卵方法制备围绝经期大鼠模型

杨溢铎，李佶，于鑫梅

(上海中医药大学附属龙华医院,上海200032)

女性围绝经期是卵巢功能停止前的过渡时期，它的本质是卵巢功能逐渐下降的过程，并且是不可逆的。围绝经期动物模型的制备对于研究绝经综合征、卵巢储备功能下降及与其相关的代谢异常疾病、心血管疾病和骨关节疾病的发病机制都具有重要的意义。雌二醇(E2)、促卵泡成熟素(FSH)、卵巢功能储备(AMH)是临床常用的卵巢功能指标。制备围绝经期动物模型的方法有多种，去势模型是制备围绝经期的经典模型，但去势模型大鼠雌激素水平呈断崖式下降，与正常围绝经期大鼠雌激素水平的大幅度波动不一致。我们前期研究认为，超促排卵可能导致女性提前出现围绝经期。孕马血清促性腺激素(PMSG)广泛用于多种动物和家畜的超促排卵，枸橼酸氯米芬(CC)是目前临床应用最广泛的促排卵激素。研究[1]发现PMSG超促排卵后常出现卵巢储备功能下降。2017年11月～2018年6月，我们采用CC灌胃的超促排卵方法制备围绝经期大鼠模型，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 7周龄SPF级SD雌性大鼠30只，体质量(180±20)g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供(许可证号码：SCXK(沪)2013-0016)。1%戊巴比妥钠；PMSG，批号：110254564，购自宁波第二激素厂；CC，批号：J0803，购自CODAL SYNTO LTD.Cyprus，高特制药有限公司.塞浦路斯。光学显微镜，OLYMPUS BX40F4；高速冷冻离心机，Eppendorf；-80 ℃超低温冰箱，Thermo。

1.2 大鼠分组及围绝经期大鼠模型制备方法 30只SD大鼠随机分为5组，每组6只，分别为A、B、C、D、E组。A、B组大鼠从动情间期开始连续2天于同一时间5、10 mg/kg的CC灌胃，间隔2 d不灌胃后重复同样操作[2]，共重复12个周期。C组大鼠从动情间期开始，连续2 d在同一时间腹腔注射PMSG 40 IU[1]，间隔2 d不注射后重复同样操作，共重复12个周期；D组大鼠从动情间期开始，连续2 d于同一时间灌胃生理盐水2 mL，间隔2 d后重复同样操作，共重复12个周期。E组为去势对照组，1%戊巴比妥钠腹腔注射，待大鼠四肢软瘫后，仰卧位固定于垫巾上，开始腹部备皮，碘伏消毒2遍，从腹部正中线开始依次剪开皮肤、肌层、腹膜后进入腹腔，翻开肠管，寻找子宫和卵巢，结扎子宫角和输卵管，剪去两侧卵巢，闭合腹腔。术后每天肌内注射青霉素钠(剂量25万U/Kg)，连续3 d，以防感染。

1.3 各组大鼠一般状态观察 12个周期给药结束后观察A至D组大鼠神态、毛发、摄食及活动情况。E组在去势术后15 d开始观察。

1.4 各组大鼠动情周期观察 A至D组从适应性饲养1周后开始，直至12个周期给药结束后30 d，每日进行阴道脱落细胞涂片。阴道涂片采用巴氏吸管吸取0.9%生理盐水0.2 mL，在阴道口反复冲洗大鼠阴道2～3次，然后将冲洗后的生理盐水均匀滴在载玻片上，晾至半干，置于95%酒精中固定30 min，经HE染色，在光镜下观察阴道上皮脱落细胞的情况，并记录动情周期。E组在去势术后15 d开始连续15 d行阴道脱落细胞涂片，观察并记录大鼠动情周期。

1.5 各组大鼠血清E2、FSH、AMH水平检测 采用ELISA法检测。给药结束后30 d，1%戊巴比妥钠麻醉A、B、C、D组大鼠，行腹主动脉采血，E组去势手术30 d后行腹主动脉采血，离心后，分离上层血清。按照试剂盒说明用ELISA法测算各组大鼠血清E2、FSH、AMH水平。重复3次，取平均值。

1.6 各组大鼠卵巢组织病理形态观察 采用HE染色。给药结束后15 d，1%戊巴比妥钠麻醉A、B、C、D组大鼠，剖腹取下双侧卵巢，去除卵巢周围脂肪后置于4%多聚甲醛溶液中固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，脱蜡，常规HE染色，置于光学显微镜下观察各组大鼠卵巢组织的病理形态。

2 结果

2.1 各组大鼠一般状态比较 A组大鼠精神欠振，毛发略黄，毛发欠光泽，毛发脱落较少，饮水及饮食量轻度减少，活动度轻度减少；B组大鼠情绪略躁动，毛发暗黄，光泽度降低，毛发脱落较少，饮水及饮食量轻度减少，活泼度轻度减少；C组大鼠精神欠振，毛发暗黄，无光泽度，毛发脱落较多，饮水及饮食量轻度减少，活动度明显减少；D组大鼠精神基本正常，毛发光泽，毛发脱落较少，饮水及饮食量正常，活泼好动；E组大鼠精神抑郁寡欢，毛发暗黄，无光泽，毛发脱落较多，饮水及饮食量明显减少，活动性明显降低，嗜睡喜卧。

2.2 各组大鼠动情周期比较 A组从给药的第5个周期开始，动情周期开始不规律，主要表现为动情后期的延长和动情周期各阶段出现的顺序发生改变，随着给药次数的增多，每个给药周期内，动情期的出现开始延迟，甚至消失，最终从第9个周期开始呈现出持续的动情间期，2只仍有规律动情周期变化，动情周期为4～5 d，其余4只动情期延长2～3 d，动情周期7～8 d。B组从给药的第5个周期开始，动情周期出现不规律，主要表现为动情后期、动情期或动情间期的延长，伴或不伴动情周期各阶段出现的顺序改变，以动情后期的延长为主，2只仍有规律动情周期变化，其余4只动情周期延长至6～8 d；C组从给药的第3个周期开始动情周期不规律，主要表现为动情间期和动情后期的延长，以及动情周期逻辑顺序的改变，从第7个给药周期开始大鼠全部呈持续的动情间期；D组空白组的大鼠动情周期仍规律地出现，一个动情周期为4～6 d；E组去势组呈持续的动情间期。

2.3 各组大鼠血清E2、FSH、AMH水平比较 结果见表1。

表1 各组大鼠血清E2、FSH、AMH水平比较

注：与D组比较，＊P<0.05；与E组比较，#P<0.05；与C组比较，△P<0.05。

2.4 各组大鼠卵巢病理形态比较 A组卵巢体积较小，表面颜色淡红，表面突起的卵泡数少于D组，始基卵泡数目少，各级生长卵泡较空白组少，成熟卵泡少，颗粒细胞层次少，卵泡液水平丰富，黄体数目多，血管数目少；B组卵巢体积中等，表面颜色鲜红，表面突起的卵泡数多，始基卵泡数目多，各级生长卵泡较空白组少，成熟卵泡少，闭锁卵泡较多，颗粒细胞层次多，卵泡液水平丰富，黄体数目少，血管数目较多；C组卵巢体积大，表面颜色淡红，各级卵泡数量少，闭锁卵泡数量多，颗粒细胞层次不丰，卵泡液水平不丰，黄体数量不多，血管数目减少；D组卵巢体积中等，卵巢血供良好，表面颜色鲜红，表面突起的卵泡数多，始基卵泡多，各级卵泡生长活跃，颗粒细胞层次多，卵泡液水平多，黄体发育好，体积大，血管数目多。

3 讨论

大鼠的动情周期一般为4～5 d，依次为动情前期，动情期，动情后期和动情间期[3]，动情前期相当于人类的卵泡期，动情期相当于排卵期，动情后期相当于黄体早期，动情间期相当于黄体中晚期和卵泡早期[4]。

本研究中，A组从给药的第5个周期开始，动情周期开始不规律，主要表现为动情后期的延长和动情周期各阶段出现的顺序发生改变，随着给药次数的增多，每个给药周期内，动情期的出现开始延迟，甚至消失，最终从第9个周期开始呈现出持续的动情间期。B组从给药的第5个周期开始，动情周期出现不规律，主要表现为动情后期、动情期或动情间期的延长，伴或不伴动情周期各阶段出现的顺序改变，以动情后期的延长为主；C组从给药的第3个周期开始动情周期不规律，主要表现为动情间期和动情后期的延长，以及动情周期逻辑顺序的改变，从第7个给药周期开始大鼠全部呈持续的动情间期。给药后除了D组的动情周期依然呈现出明显的规律外，其余各组动情周期均出现了明显的不规律。其中以C组动情周期的变化与E组最相似，出现了动情周期的停滞。CC给药两组动情周期的改变类似，均以动情周期的延长和动情期的延长为主。有文献[5]报道，大鼠在衰老过程中发生的第一个变化即动情周期的延长，通常8个月以后的大鼠开始出现[6]。同时，随着大鼠的衰老，动情周期开始出现动情期的延长，阴道涂片呈现持续的上皮角质化，此时进入恒定发情期[7]。这是排卵障碍的表现，此时大鼠血清中的E2、睾酮、雄甾酮和孕酮较低且恒定[8]。

CC在给药后超过一半的大鼠出现了动情周期的延长和动情期的延长，这点与正常衰老大鼠的动情周期变化类似，反应了卵巢功能的下降[9]。而PMSG组全部大鼠的动情周期发生改变，以持续的动情间期与动情前期的交替为主，出现了动情周期的停滞，所以相比于CC组，PMSG组的动情周期变化更接近于去势组和正常衰老大鼠。

许多研究者[11]认为，AMH是预测卵巢储备功能和卵巢反应性的金标准。AMH是转化生长因子β(TGF-β)家族成员，其作用之一就是抑制原始卵泡激活，减慢卵巢储备被耗尽的速率。AMH主要表达于窦前卵泡和窦卵泡[11]，其水平能反映窦卵泡池的大小，代表了剩余原始卵泡的数量，可以定量反映卵巢储备。本研究中，各组与E组去势组相比较，血清AMH水平间差异均无统计学意义，我们分析是因为AMH本身数值较低，测量误差较大，且样本量较小，对此次的结果分析造成了一定的干扰。

A、B、C组间血清E2水平与D组相比无统计学差异，同时均明显高于E组，然而三组大鼠的一般状态、动情周期变化和卵巢切片均提示卵巢功能有下降。我们分析，可能源于大鼠所处的动情周期的不同。因为去势组的动情周期均处于动情间期，而A、B、C组的大鼠动情周期发生了紊乱，但并非完全停滞于动情间期，依然有排卵发生。而在不同的动情周期阶段E2的变化非常大，排卵前的E2水平必然高于动情间期，因为动情间期相当于人类的黄体中后期和卵泡前期。同时，围绝经期大鼠的雌激素水平相比于青年大鼠，本身就处于正常范围上下的大幅度波动状态，直至绝经期，雌激素水平才明显下降，持续稳定在低值。

CC低剂量组和高剂量组的卵巢切片属“+”，即见生长卵泡、成熟卵泡及黄体，相比于空白组，成熟卵泡数、黄体数较少，颗粒细胞层次较少，说明此时的大鼠卵巢已经出现了排卵障碍，卵巢功能已有下降；PMSG组属“++”，可见成熟卵泡及黄体，相比于空白组，黄体数较多，颗粒细胞层次较少，血管较少，表明此时C组的卵巢组织各级生长卵泡数目减少，卵巢血供不丰富，其功能已经出现了明显下降。综合卵巢切片看，C组的卵巢功能相比于A、B组，下降得更明显，更符合围绝经期卵巢的病理改变[12]。

与D组相比，E组血清E2、AMH水平明显降低，FSH水平明显增高且大鼠的动情周期持续处于动情间期。但去势模型的雌激素水平呈断崖式下降，与正常围绝经期大鼠雌激素水平的大幅度波动不一致，且卵巢切除亦影响了雄激素等其它激素的分泌，这些激素可能在围绝经期中起重要的作用，并对下丘脑和垂体分泌的激素有反馈作用[13]，与正常围绝经期的生理变化不一致。而此次采用超促排卵的方法进行造模，激素水平的变化和动情周期的改变更加贴近于围绝经期的生理变化，体现出了卵巢功能逐渐衰竭的过程。

综上所述，5、10 mg/kg的CC灌胃大鼠动情周期延长，血清E2、AMH水平均降低。超促排卵方法(5、10 mg/kg的CC灌胃)可成功制备围绝经期大鼠模型，所得大鼠卵巢功能降低。