非小细胞肺癌组织中GLI3蛋白的表达变化及其意义

陈盈盈，李晓琴，刘春玲

(新疆医科大学第三临床医学院(附属肿瘤医院)，乌鲁木齐 830011)

根据国际癌症研究署2018年发布的全球癌症统计资料显示，当今世界肺癌仍然是发病率和病死率最高的恶性肿瘤，严重威胁人类的生命安全[1]。Hh信号通路发现以来，不仅在调控人类胚胎发育和干细胞的分化中至关重要，而且和恶性肿瘤密切相关，其在非小细胞肺癌(NSCLC)演化中起重要作用[2～4]。GLI3蛋白作为通路下游转录因子GLI蛋白家族中的一员，具备双向调节功能[5]，在Hh信号通路中的作用十分关键，但目前罕有关于GLI3蛋白NSCLC的研究。本研究通过观察NSCLC组织中GlI3蛋白的表达变化，分析GLI3蛋白表达与NSCLC临床病理参数、预后的关系，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2013年1～12月新疆医科大学第三临床医学院(附属肿瘤医院)收治的NSCLC患者82例，男56例，女26例；年龄39～75岁，中位年龄62.5岁；有吸烟史26例；有淋巴结转移35例；瘤体>3 cm 38例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期46例，ⅢA期36例；病理类型：腺癌43例，鳞癌39例。手术留取NSCLC组织82例份及癌旁组织(距肿瘤组织5 cm以外)各82例份。所有组织样本取下后立即液氮冷冻，随后转入-80 ℃冰箱保存。

1.2 NSCLC及癌旁组织中GLI3蛋白检测方法 采用免疫组化法。选取NSCLC及配对的癌旁石蜡组织标本各82例份。以4 μm厚度为基准连续切片，60 ℃下烤片3 h，浸泡二甲苯、过梯度酒精脱蜡(依次顺序为100%-100%-95%-95%-90%-80%-70%)、入去离子水水化；修复组织抗原后，使用免疫组化油笔圈住组织，经3%过氧化氢去离子水孵育10 min，再分3次置入磷酸盐缓冲溶液(PBS)中；后吸除多余PBS液，即刻滴入第一抗体，入37 ℃恒温箱孵育1 h，待孵育完成后，使用吸水纸吸去多余一抗，再次使用PBS液冲洗3次同上；擦干多余PBS液，滴加二抗，室温下孵育30 min，重复上法PBS中浸洗3次，每缸仍为5 min；擦干切片，置入新鲜配置的DAB显色液中显色，清水冲洗后入苏木素染色液中复染1 min，浸温水返蓝；依次过梯度酒精脱水(顺序为70%-80%-90%-95%-95%-100%-100%)，依次浸泡缸2缸二甲苯透明，封片。光镜下观察结果。以同一条件下染色的阳性颗粒作阳性对照组，用PBS代替一抗作阴性对照组。免疫组化结果判定标准：GLI3蛋白主要定位在细胞核和细胞质，当出现淡黄色至深褐色为阳性细胞，在目标表达部位染色后，采用染色强度与阳性细胞计数相结合的二级计分法进行评分，染色强度无计0分、淡黄色计1分、黄褐色计2分、深褐色计3分，阳性细胞数为10%计0分、10%～25%计1分、26%～50%计2分、51%～100%计3分，两者相乘，<6分为低表达，>6分为高表达[6]。

1.3 患者预后随访 采用查阅患者门诊复查和住院复查资料，以及电话、短信、微信、电子邮箱等方式进行随访。依据NSCLC指南和诊疗规范，术后第1年内，无临床症状或症稳定的患者，每3个月行1次门诊或住院检查随访，此后每6个月随访复查1次。随访至随访时间结束或患者死亡，失访者随访时间按截尾数据处理。

1.4 统计学方法 采用SPSS24.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC及癌旁组织中GLI3蛋白表达比较 NSCLC及癌旁组织中GLI3蛋白高表达者分别为49例(59.8%)、31例(37.8%)，两者比较，P<0.05。

2.2 GLI3蛋白高表达与NSCLC临床病理参数之间的关系 结果见表1。

表1 GLI3蛋白高表达与NSCLC临床病理参数的关系

注：GLI3蛋白高表达与NSCLC肿瘤直径及肿瘤淋巴结转移有关(P均<0.05)。

2.3 NSCLC组织中GLI3蛋白表达与患者预后的关系 根据GLI3蛋白表达水平将NSCLC患者分为高表达者(49例)及低表达者(33例)，中位生存时间分别为50个月、57个月，两者比较，P<0.05。

3 讨论

近年随着医疗水平的进步，肺癌的总体生存期有了一定程度的提高，但是预后仍然不够理想，个体化差异太大，5年生存率为4%～18%[1]，整体预后仍待改善。随着分子生物学的不断发展及其在肿瘤学领域的不断应用，肿瘤的研究早已进入了基因分子水平。Hh信号通路因其在机体调控的广泛作用和疾病中异常改变，吸引了无数研究者的关注。在脊椎动物中，HH信号通路的主要组成结构有作为配体的三个同源Hh分泌蛋白(SHH、DHH、IHH)及分布于靶细胞膜上的受体Smo蛋白和转录因子GLI蛋白家族等[7]。果蝇在Hh信号通路中只有一个GLI转录因子的同源基因(Ci)，而在生命架构更高级的脊椎动物中，GLI蛋白家族有3个成员(GLI1、GLI2和GLI3)[8]。近年研究揭示，GLI蛋白不仅参与Hh信号传导，而且与肺恶性肿瘤的发生发展密切相关，如在小细胞肺癌中，常常伴有GLI蛋白的异常激活[9]；GLI1和GLI2则可介导NSCLC癌细胞的增殖、凋亡及耐药等机制的发生[1,11]；但作为Hh-GLI信号通路中的主要传导介质，GLI3蛋白在NSCLC的研究尚浅。2010年白晓燕等[12]曾阐述，GLI3在NSCLC组织中的表达水平高于正常组织，但迄今为止，关于GLI3蛋白在NSCLC中的表达差异及与NSCLC临床病理参数、患者预后关系的研究仍不充分。

Steg等[13]发现，在胰腺癌中，应用siRNA干扰GLI3蛋白的表达，可减弱癌细胞的活力；Trnski[14]则发现，应用氯化钾抑制糖原合成酶激酶-3β，可以促进GLI3蛋白加工成抑制形态和减少直肠癌细胞增殖，并可诱导肿瘤细胞凋亡；此外在急性髓性白血病中，有学者通过降低GLI3蛋白抑制区活性，发现可以阻止肿瘤细胞增殖[15]。钟文等[16]应用siGLI3干扰GLI3蛋白表达，发现GLI3蛋白的表达能促进癌细胞迁移；Fu等[17]进行的功能实验表明，GLI3蛋白甲基化在体外和体内有助于NSCLC中的肿瘤生长和转移。因此，我们可以推测，GLI3蛋白在部分肿瘤中呈高表达，且可通过调控GLI3蛋白的活性，促进肿瘤的发生发展；并且在NSCLC中，GLI3蛋白可能存在有2种不同的调控机制和作用方式。本研究显示，NSCLC癌组织中GLI3蛋白表达水平高于癌旁组织。

肿瘤体积大小是肿瘤TNM分期的重要决定因素，转移则一直以来被认为是肿瘤导致患者死亡的主要因素，而其中淋巴结转移是NSCLC患者最常见也是最主要的转移方式，是显著影响其临床预后的重要因素[18]。Popper等[19]发现，肿瘤通过淋巴路径的转移相比较血行扩散，通常需要更长的时间才会出现远处转移。Ye等[20]最近的一项研究表明，淋巴结转移与NSCLC患者的长期癌症特异性存活率(CSS)相关。此外还有许多研究已证实，肿瘤直径和淋巴结转移之间密切相关，如Rami-Porta等[21]进行的大量数据的研究发现，肿瘤体积越大越大，NSCLC患者的5年生存率越小，淋巴结转移率越高，并随着肿瘤向肺周围组织转移的程度而增加，生存恶化的趋势越显著。故寻找能可靠预测患者肿瘤转移的因素，是研究者期望解决的难题。Armas等[22]研究发现，在恶性肿瘤的早期阶段，GLI3蛋白在HH-GLI通路中优先表达。本研究显示，NSCLC组织GLI3蛋白高表达主要与患者的肿瘤直径及淋巴结转移有关，可以预测GLI3蛋白可能是肿瘤增殖发育旺盛和转移倾向明显的一个潜在标志物。

尽管胚胎期GLl3主要在Hh信号通路起负调控作用[23]，但本研究显示，GLI3蛋白的高表达是NSCLC患者预后生存的独立影响因素，GLI3蛋白可通过抑制NSCLC细胞增殖分化，增强肿瘤细胞的转移能力，促进肺癌的进展和转移。结合Marie-Ange等[24]研究发现，GLI3蛋白通过增加细血管密度，促进肿瘤病情进展。本研究显示，GLI3蛋白表达水平高表达者中位生存时间较低表达者短。因此我们推测，GLI3蛋白对NSCLC病情的发展具有重要的促进作用，但是其具体作用方式还需进一步的研究，同时GLl3对NSCLC的影响也可能具有多种的作用形式。

总之，NSCLC组织中GLI3蛋白呈广泛高表达状态，且与肿瘤直径及淋巴结转移关系密切，GLI3蛋白可能在NSCLC的发生发展中起一定的作用。