糖皮质激素治疗对系统性红斑狼疮患者外周单个核细胞TLR7和TLR9表达的影响及相关因素分析

许敏玲 陈桃 蔡琪

南方医科大学附属小榄医院风湿免疫科（广东中山528415）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种累及多系统、多器官的自身免疫性疾病。发病机制涉及遗传、环境和感染等多种因素，其特征包括B 细胞的过度活跃，自身抗体产生，以及对自身抗原的耐受性丧失，最终形成沉积在组织中并诱导炎症的免疫复合物［1］。Toll 样受体（Toll-like receptors，TLRs）是一类进化上高度保守的模式识别受体，可识别不同的病原体相关分子模式，通过多种信号传递途径调节免疫系统功能。最近越来越多的研究［2-5］表明，TLRs 可能参与SLE 的发病机制，在B 细胞的激活和免疫复合物形成等过程起重要作用。迄今，人类TLR 家族成员现已确认的有12 个（TLR 1～12）。其中TLR7 和TLR9 被认为与SLE 的发病最为密切［6］。TLR7 和TLR9 可通过识别含DNA 或RNA 内源性的抗原，诱导产生自身免疫应答，或参与树突细胞和B 细胞的活化。既往研究［6-10］显示SLE 患者的疾病活动与多种TLRs（包括TLR2，TLR4，TLR7，TLR9 等）的表达水平相关。然而，SLE 的临床表征和实验室指标与TLRs 的相关性仍不明确，受不同种族、检测条件、实验设计的影响存在较大的差异。此外，糖皮质激素是治疗SLE 的主要药物，用于减轻炎症反应和抑制免疫系统的活动性。糖皮质激素可能直接或间接对免疫细胞的TLRs 激活机制产生影响［11］，从而影响SLE 患者中TLR7 和TLR9 的表达。因此，本研究将探明SLE 患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）TLR7 和TLR9 的表达水平与临床表征的相关性，并重点分析糖皮质激素抗炎治疗对TLR7 和TLR9表达的影响，了解TLRs 介导的免疫调节与糖皮质激素治疗之间的联系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 研究对象为2016年11月至2017年12月间南方医科大学附属小榄医院门诊和住院收治的SLE 患者40 例。所有病例符合1997年美国风湿病学会修订的SLE 标准。其中包括初次诊断并未行糖皮质激素治疗的SLE 患者16 例（初次诊断组），以及在过去1 个月中糖皮质激素维持治疗的患者24 例（激素治疗组，激素治疗期≥1 个月）。另选取19 例健康体检者抗凝外周静脉血标本作为健康对照组，均排除SLE、其他自身免疫性疾病和慢性炎症性疾病，其中女17 例，男2 例，采用年龄段、性别匹配。研究对象全部知情同意并签署知情同意书，医院伦理委员会同意开展此项研究。

1.2 临床数据收集及研究变量定义 从病历收集的信息包括患者人口学特征（年龄、性别），以及SLE 相关的临床表现：盘状皮损、蝶形红斑、光敏等，实验室检查包括血细胞分析、自身抗体包括抗核抗体、抗ds-DNA 抗体、抗Sm 抗体以及血沉、C-反应蛋白、补体C3 和C4。患者均进行了常规临床症状调查、检测指标的测定，并根据系统性红斑狼疮疾病活动指数（disease activity index for lupus patients，SLEDAI）进行评分。合并皮肤损害定义为至少有一项皮肤病变指标（包括盘状皮损、蝶形红斑、光敏）；合并肾脏损害定义为至少有一项异常检测指标（包括血肌酐、血尿素、血尿酸和尿蛋白）。糖皮质激素日均剂量为过去1 个月的平均日剂量（用等效强的松换算）。糖皮质激素治疗期为不间断的糖皮质激素治疗时间总和。

1.3 外周血淋巴细胞的分离和RNA 提取 抽取SLE 患者和正常人外周血6 mL，EDTA 抗凝，采用Ficoll 密度梯度离心法淋巴细胞分离液（达科为公司）分离PBMC，-80 ℃保存备用。细胞总RNA 的提取参照Qiagen RNA mini kit 提取说明书进行。抽提的总RNA 以DNaseⅠ消化，再以氯仿-异丙醇提取，得到的RNA 以DEPC 水溶解。用紫外分光光度计测定RNA 浓度及纯度，用凝胶电泳法检测RNA 的完整性。

1.4 TLR7 和TLR9 基因表达的检测 将提取总RNA 使用反转录试剂盒（日本Takara 公司）进行反转录。取1 μL 提取的RNA 以OligodT 进行逆转录。反应条件为：42 ℃60 min，75 ℃15 min，反转录生成的cDNA 于-80 ℃保存备用。使用SYBR 试剂（日本Takara 公司）进行实时定量PCR 反应，采用7500 Real-time PCR System（美国ABI 公司）检测TLR7 和TLR9 基因的转录水平，以β-actin 为内参照。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。TLR7：正向引物：5′-TCAAGCCTTAGATTGGGATGTC-3′；反向引物：5′-CCAGAGATTGATTTGGGAATTTGTG-3′，共144 bp。TLR9：正向引物：5′-AGTCCTCGACCTGGCAGGAA-3′；反向引物：5′-GCGTTGGCGCTAAGGTTGA-3′，共168 bp。β-actin：正向引物：5′-GCACCACACCTTCTACAATGAGC-3′；反向引物：5′-GGATAGCACAGCC TGGATAGCAAC-3′，共156 bp。PCR 反应扩增条件：94 ℃预变性5 min，50 个循环（94 ℃，变性30 s；53 ℃，退火30 s；72 ℃，延伸30 s）。每轮PCR 反应重复两次。根据待测标本的Ct 值，以β-actin 为内参照，采用相对定量法，以2-△Ct表示标本中TLR7 和TLR9 基因相对表达量。为了显示与健康对照组的变化比例，所有TLR7 和TLR9 相对表达量值被除以健康对照组的均值，进行标准化计算。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计软件储存和分析数据。计量资料以均数±标准差表示。两组计量资料采用t检验或Kruskal-Wallis 非参数检验，两组计数资料采用卡方检验。多组均值比较采用单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用事件后Tukey 检验。不同临床检测指标与TLR7 和TLR9 的相对表达量进行单因素直线相关分析，双变量资料计算Pearson 相关系数，抗体滴度资料采用Spearman 等级相关分析。相关分析中P＜0.1 的变量进入线性回归分析，采用步进法筛选模型。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TLR7 和TLR9 mRNA 在SLE 患者和健康对照组PBMC 的表达水平 反转录PCR 显示TLR7和TLR9 在SLE 患者和健康对照组的PBMC 细胞中均有表达。通过定量PCR 测定TLR7 和TLR9 的转录水平，与健康对照组相比，初次诊断组SLE患者的TLR9 转录水平增高至（162 ± 58）%；TLR7 初次诊断组的mRNA 水平提高更为显著，达（207±45）%，差异均具有统计学意义（P＜0.01，图1）。激素治疗组TLR7 和TLR9 的表达低于初次诊断组，两组间的差异仅在TLR7 存在统计学意义（P＜0.01）。激素治疗组的TLR7 和TLR9 仍高于健康对照组（P＜0.05）。

2.2 SLE 患者PBMC 的TLR7 和TLR9 转录水平与SLE 活动指数的相关关系 由于糖皮质激素治疗与SLE 病情活动具有密切联系，有必要首先探讨SLE 病情活动与TLR7 和TLR9 表达的相关关系。将两组的TLR7 和TLR9 相对转录水平与SLE活动指数（SLEDAI）制作散点图（图2），相关分析显示TLR7 与TLR9 均与SLEDAI 存在正相关关系（P＜0.01），TLR9 与SLEDAI 的Pearson 相关系数为0.566，高于TLR7（r=0.401）。为排除糖皮质激素治疗的影响，单独对初次诊断组进行SLEDAI 与SLE 活动指数的相关分析，结果显示TLR7 与SLEDAI 的相关系数为0.107；而TLR9 与SLEDAI 的相关系数为0.506（P＜0.05）。

图1 定量PCR 检测TLR7 和TLR9 在SLE 患者和健康对照组PBMC 的转录水平Fig.1 Quantification of TLR7 and TLR9 mRNA expression in the PBMC isolated from SLE patients and healthy controls using real-time PCR

图2 SLE 活动指数与PBMC 细胞TLR7 和TLR9 基因转录水平的相关关系Fig.2 Correlation of SLEDAI score with TLR7 and TLR9 mRNA levels in PBMC

2.3 SLE 患者临床表征与TLR7 和TLR9 基因转录水平的关系 两组患者的病史、临床特征和实验室检查资料见表1。为了进一步探讨与TLR7、TLR9 表达的可能相关因素，利用相关分析评价SLE 患者不同的临床指标与TLR7 与TLR9 表达的联系。如表2所示，TLR7 的转录水平与SLEDAI、抗Sm 抗体滴度成正相关关系（P＜0.05）。对于TLR9，年龄、SLEDAI 和抗dsDNA 抗体滴度等变量与之具有正相关关系（P＜0.05）。糖皮质激素治疗指标包括剂量和疗程与TLR7 的相关性无统计学意义，而剂量与TLR9 的表达具有一定的相关关系（r=0.362，P=0.082）。将简单相关分析中P＜0.1 的可能指标利用多元线性回归模型进一步筛选影响TLR7 和TLR9 表达的相关变量（表3）。结果显示与TLR9 表达相关的变量（P＜0.05）根据偏相关系数的大小依次为SLEDAI、C4 水平和糖皮质激素剂量；而TLR7 转录水平仅发现与SLEDAI 具有正相关关系。

表1 入组SLE 患者的临床表征和实验室检查Tab.1 Demographic and clinical characteristics of SLE patients

表2 不同临床特征、实验室指标与TLR7、TLR9 转录水平的二元变量相关分析Tab.2 Bivariate correlation analysis between TLR7，TLR9 mRNA levels and clinical features in SLE patients

表3 多元线性回归分析TLR7 和TLR9 转录水平的预测变量Tab.3 Predictive factors associated with TLR7 and TLR9 mRNA expression levels in multivariate linear regression

3 讨论

TLRs 是一种重要的先天性免疫识别受体，能够识别病原微生物对机体的入侵，触发免疫应答，对机体的免疫调节具有至关重要的作用。TLRs的配体分为外源性配体和内源性配体。所谓外源性配体是指来自宿主外的病原微生物成分，而内源性配体主要指来自宿主细胞的一些物质，如宿主细胞在应激状态或损伤时释放的热休克蛋白或核酸等。近年越来越多的研究［8，12］证实TLRs 不仅识别外源侵入的微生物病原体，还能够识别内源性分子，尤其是SLE 相关抗原。

SLE 的特征是抗核抗体的血清水平升高，而抗核抗体是一组针对细胞核内的核酸-蛋白质分子复合物而产生的自身抗体。识别核酸的TLRs 主要是TLR3、TLR7 和TLR9 这3 种亚型。与在细胞表面上表达的其他TLRs 不同，3 种核酸特异性TLRs 定位于内体中。TLR3 结合双链RNA，TLR7结合单链RNA，TLR9 结合未甲基化的DNA。目前已有研究［13-15］提示TLR7 和TLR9 对SLE 患者的自身抗原的产生有重要作用。既往报道［10］显示SLE患者总PBMC 中TLR7 和TLR9 mRNA 的表达量较对照组增高，并且与IFN-α表达相关。活动期SLE患者相比缓解期，其B 淋巴细胞和单核细胞TLR9的表达增加［16］。在SLE 患者中，TLR9 的表达与SLEDAI、抗dsDNA 抗体正相关，而与C3、C4 负相关［17］。然而，部分研究结果［10］显示SLE 组与健康对照组之间TLR7 表达无差异。这可能与受试者之间的高度变异有关。有研究显示［18-21］不同种族人群的TLR7 和TLR9 单核苷酸多态性与SLE 的相关性具有不同的特点，TLR7 和TLR9 的表达水平也存在种族差异。本研究主要以南方汉族人的研究对象，提示SLE 患者PBMC 的TLR7 和TLR9 mRNA 转录水平增高具有统计学意义，并与SLE 的病情活动程度指标SLEDAI 具有正相关关系（P＜0.05）。然而，TLR7 和TLR9 的关联因素并不一致。TLR9 与SLEDAI 的Pearson 相关系数为0.566，高于TLR7。在排除糖皮质激素治疗影响的初次诊断组中，SLEDAI 与TLR9 的相关性具有统计学意义，而与TLR7 无统计学意义。此外，TLR9 还与年龄、抗dsDNA 抗体的相关性具有统计学意义，而TLR7 仅与SLEDAI 抗Sm 抗体相关。与相关分析研究结果相符的是，TLR9 主要用于识别双链DNA（dsDNA），而TLR7 识别核内RNA，而Sm 抗原主要由小核RNAs 形成的蛋白复合物。TLR9 与抗dsDNA 抗体，TLR7 与抗Sm 抗体的独特相关性提示了不同TLRs 介导的机制在相关核抗原的自身免疫应答的发展起重要作用。在动物实验中，用RNA和DNA-蛋白质复合物刺激TLR7 和TLR9 均可诱导树突细胞和自身反应性B 细胞的过度活化，导致高滴度的自身抗核抗体［13-14］。研究推测，SLE 患者体内凋亡或坏死的细胞释放出核酸，而机体免疫系统又缺乏对此核酸抗原清除的能力，异常高表达的TLR7 和TLR9 通过识别释放出的单链RNA或DNA，激活处于静止状态的自身免疫细胞，从而导致SLE 患者自身抗体的产生。值得注意的是，虽然TLR7 和TLR9 具有相似的表达模式并共享相同的信号传导途径［22］，但是在SLE 小鼠模型中敲除TLR7 或TLR9 基因却得到相反的结果：TLR7 缺失可抑制SLE 的病理生理过程；而TLR9 缺失却表现自身免疫性皮肤病的发生率明显升高，狼疮性肾炎加重，病死率增高［23-25］。TLR7 和TLR9 在SLE疾病发展过程中的作用仍有待进一步明确。

糖皮质激素既是人体内重要的生理物质，又是临床广泛应用的免疫抑制剂。在体内，由肾上腺皮质球状带分泌的类固醇激素，主要包括皮质醇和皮质酮。临床作为药物使用的糖皮质激素主要包括氢化可的松、泼尼松（强的松）、地塞米松等，其药理作用主要包括抗炎、免疫抑制、抗休克和抗毒作用。糖皮质激素作为SLE 患者治疗的基础用药，与介导固有免疫应答的模式识别受体（如TLR7 和TLR9）的关系仍不清楚［17，26］。本研究通过比较糖皮质激素治疗的SLE 患者组和未受糖皮质激素治疗的初次诊断组，研究其TLR7 和TLR9 的mRNA 表达水平，结果提示糖皮质激素治疗组的TLR7 和TLR9 的mRNA 水平均低于初次诊断组，其中TLR7 差异具有统计学意义。两组TLR7 和TLR9 的表达水平仍高于健康对照组。由于糖皮质激素治疗可导致SLE 病情活动和多项免疫指标的改变，单纯的组间比较或相关分析难以确定糖皮质激素治疗对TLR7 和TLR9 的影响。因此，用疗程和日均剂量两个参数定义糖皮质激素治疗水平，通过多元线性回归模型筛选影响TLR7 和TLR9 表达的变量。结果提示TLR7 主要相关变量为SLEDAI，而TLR9 的主要相关变量包括SLEDAI、补体C4 水平、糖皮质激素日均剂量。多项研究表明，糖皮质激素可以影响免疫细胞的分化发育、表型特征、抗原摄取和抗原加工提呈等多种生物学功能。ROZKOVA 等［27］发现糖皮质激素使树突细胞TLR2、TLR3 和TLR4 mRNA 表达增加，但是这种TLRs 表达调节具有双向性，与细胞的功能状态有关，并与糖皮质激素的浓度正相关。尽管这些研究结果支持了糖皮质激素治疗对TLRs 的表达调节，仍需要进一步的大样本纵向研究设计，包括前瞻性的队列研究等，确定在SLE 患者中TLRs表达变化与糖皮质激素治疗的时间关系和剂量反应性。

综上所述，本研究对初次诊断和经糖皮质激素治疗的SLE 患者进行总PBMC 的TLR7 和TLR9的表达分析，与既往研究一致，结果显示SLE 患者TLR7 和TLR9 的表达增高，与病情活动指数正相关，TLR9 的表达还与糖皮质激素治疗剂量和补体C4 存在较高的相关性。TLR7 和TLR9 异常表达和活化可能在SLE 疾病进程和糖皮质激素治疗中发挥作用。进一步阐明TLR7 和TLR9 在自身免疫反应发展中的精确分子作用将有助于优化SLE 治疗策略。