苗梦媛 刘守胜 赵真真 徐颖誉 辛永宁 宣世英
1南京医科大学附属青岛临床医学院(山东青岛266011);2青岛市市立医院中心实验室(山东青岛266071);3青岛大学(山东青岛266071);4青岛市市立医院感染科(山东青岛266011)
冠心病是影响全球的主要心血管疾病之一,已被证明是发达及发展中国家死亡的主要病因[1]。遗传因素在冠心病的发生、发展中起到了重要作用[2]。OZAKI 等[3]首次通过全基因组关联研究(GWAS)发现细胞毒素-α基因位点与心肌梗死有关。目前为止,GWAS 已经发现了163 个冠心病遗传易感基因[4]。进一步研究冠心病遗传易感因素,对冠心病的早期诊断和预后具有重要意义。
PNPLA3 属 于patatin 样 磷 脂 酶 域(PNPLA)家族,是由481 个氨基酸组成的脂肪滋养蛋白。PNPLA3 rs738409 位点变异可降低酶的活性,阻止甘油三脂水解,导致甘油三脂的蓄积,从而影响血脂水平[5]。血脂异常与冠心病密切相关,故推测PNPLA3 rs738409 基因多态性很有可能为冠心病潜在的发病机制之一。然而国外关于PNPLA3基因多态性与冠心病的相关性研究较少,国内尚无相关报道。本文将针对PNPLA3 rs738409 位点多态性与青岛地区汉族人群冠心病的关系进行探讨。
1.1 研究对象 本试验遵循《赫尔辛基宣言》及其附录的准则,获得本院伦理委员会批准[6]。所有受试者均签署书面知情同意书。选取2018年7月至12月青岛市市立医院收入院的199 例冠心病患者为研究对象。通过经皮冠状动脉造影确诊为冠心病,并且由两位经验丰富的介入心脏病学家进行评估。诊断标准依据中华医学会心血管病分会制定的诊断标准,冠状动脉至少一支主要分支管腔直径狭窄在50%以上[7]。排除标准:(1)合并其他心脏疾病;(2)既往接受静脉溶栓、冠状动脉支架置入术或冠状动脉旁路移植术的患者。对照组为同期本院体检中心健康体检的无冠心病的人群,共纳入160 例。所有受试者均被排除在糖尿病、严重感染、严重肝肾功能不全、恶性肿瘤及药物滥用史,相互之间无亲缘关系。采用问卷调查法收集受试者的基础临床信息。
1.2 标本采集 所有受试者均于空腹12 h 后于次日清晨抽取4 mL 正中静脉血,分两管置于EDTA抗凝管中,其中一管抗凝血送检验科,用于丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、血糖(Glu)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)检测;另一管抗凝管置于-80 ℃冰箱中保存,以备DNA 的提取,用于基因型的检测。同时对受试者性别、年龄、身高等基本信息进行统计,计算体质量指数(BMI)= 体质量(kg)/身高(m)2[8]。本研究未记录包括运动和饮食情况在内的环境因素。
1.3 DNA 提取及基因型检测 采用血液基因组DNA 提取试剂盒(百泰克生物技术有限公司,北京)进行全血基因组DNA 提取,提取的基因组DNA存放于-20 ℃冰箱备用。采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法进行PNPLA3目的基因的扩增,检测基因型。PCR 引物由北京博淼生物科技设计合成,具体引物序列为:上游引物:5′-ACGTTGGATGCCCCTCTTATCTCTGTTTCG-3′下游引物:5′-ACGTTGGATGCAGTGTCACTTCATTTAGCC-3′。引物浓度均为10 μmol/L,-20 ℃冰箱保存。PCR 扩增程序为:首先94 ℃预变性30 s,然后进行40 个循环的扩增反应,每个扩增反应的程序为94 ℃变性5 s,52 ℃退火5 s,80 ℃延伸5 s。循环结束后保持72 ℃运行3 s,后降至4 ℃保存。对所得到的PCR 产物进行去磷酸化处理,然后进行目的序列的单碱基延伸反应,对所得产物进行质谱分型鉴定,检测结果使用TYPER 4.0 软件获取原始数据。
1.4 统计学方法 采用SPSS 24.0 软件对所得数据进行统计分析。采用χ2检验分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡法则,以确认样本的群体代表性。采用χ2检验分析两组间性别、基因型及等位基因频率的差异性。符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示,两组间比较采用t检验;不符合正态分布的用中位数(最小值~最大值)表示,两组间比较采用Wilcoxon 秩和检验。基因多态性与冠心病发生的相对风险度以比值比(OR)及其95%置信区间(95%CI)表示,应用非条件Logistic 回归模型计算OR及95%CI。以P<0.05 为差异有统计学意义。
2.1 一般资料 冠心病组共纳入199 例患者,其中男112 例,女87 例;健康对照组共纳入160 例,其中男74 例,女86 例。两组研究对象性别比例的差异无统计学意义(P>0.05)。冠心病组患者的年龄、体质量、BMI、Glu、ALT、γ-GGT、ALP 和TBIL水平显著高于健康对照组,HDL 水平显著低于健康对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。
2.2 PNPLA3 rs738409 基因型及等位基因的频率分布 在冠心病组和对照组均检出CC、CG、GG3种基因型,两组rs738409 基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律(冠心病组χ2=0.210,P=0.647,对照组χ2=0.001,P=0.971),具有群体代表性。两组间基因型及等位基因的分布频率的差异均无统计学意义(均P>0.05,表2)。非条件Logistic 回归模型分析显示:CG 、GG 基因型携带者分别与CC 基因型携带者相比较,二者差异均无统计学意义(均P>0.05)。CG + CG 携带者与CC 携带者相比,发病风险未增加(OR=1.037,95%CI:0.683~1.575,P=0.865);调整年龄、性别、BMI 后,差异仍无统计学意义(校正OR=1.127,95%CI:0.640~1.986,P=0.678)。G 等位基因的携带者对比C 等位基因携带者,所得结果差异无统计学意义(P>0.05),在调整年龄、性别及BMI 的影响后,结果仍无改变(P>0.05,表3)。
2.3 不同组内突变等位基因非携带者与携带者之间临床特征的比较 在冠心病组、健康对照组的各自组内比较中,PNPLA3 rs738409 G 等位基因的携带者与非携带者之间年龄、性别、BMI、Glu、TG、TC、HDL、LDL、ALT、AST、γ-GGT、ALP 及TBIL 指标比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表4。
表1 冠心病组和对照组一般临床资料比较Tab.1 Clinical characteristics of patients with CAD and controls ±s
表1 冠心病组和对照组一般临床资料比较Tab.1 Clinical characteristics of patients with CAD and controls ±s
注:BMI,体质量指数;Glu,血糖;TG,甘油三酯;TC,总胆固醇;HDL,高密度脂蛋白;LDL,低密度脂蛋白;ALT,丙氨酸氨基转移酶;AST,天门冬氨酸氨基转移酶;γ-GGT,谷氨酰转肽酶;ALP,碱性磷酸酶;TBIL,总胆红素
t/χ2/Z 值15.220 3.575 1.464 2.716 2.568-6.632-1.955 1.475-7.765 1.687-3.654-1.823-4.357-4.078-2.070 P 值<0.001 0.059 0.144 0.007 0.011<0.001 0.051 0.141<0.001 0.093<0.001 0.068<0.001<0.001 0.038指标年龄(岁)男/女(例)身高(cm)体质量(kg)BMI(kg/m2)Glu(mmol/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)HDL(mmol/L)LDL(mmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)γ-GGT(U/L)ALP(U/L)TBIL(μmol/L)冠心病组(n=199)67.35±11.56 112/87 168.49±6.34 69.84±10.58 24.61±3.29 5.24(2.28~18.33)1.36(0.05~6.09)4.57±1.32 1.00(0.35~1.83)2.78±1.08 21.95(5.70~156.66)21.82(10.13~223.90)27.50(9.47~171.78)81.42(28.72~194.44)13.40(2.50~63.90)对照组(n=160)48.21±12.19 74/86 167.34±8.13 66.61±11.86 23.70±3.39 4.56(2.92~17.08)1.18(0.41~6.67)4.37±1.12 1.28(0.50~3.60)2.62±0.59 18.23(6.49~236.13)20.46(10.94~150.43)19.61(7.52~374.46)69.65(30.70~182.29)12.05(3.90~29.20)
表2 冠心病组和对照组PNPLA3 rs738409 基因型和等位基因的分布Tab.2 Distributions of the PNPLA3 rs738409 genotype and allele in CAD and control groups 例(%)
冠心病是心血管病中首要危险因素,其发病率及病死率逐年上升。PNPLA3 是调节TG 代谢的重要因子,大量证据表明TG 与罹患冠心病风险呈正相关,降低TG 水平可降低冠心病发生风险[9]。本研究采用病例对照的研究方法,对PNPLA3基因多态性与冠心病的相关性进行探讨。本研究结果显示PNPLA3 rs738409 位点多态性与冠心病发病风险无显著相关性,调整混杂因素后,差异仍无统计学意义。该结果与此前墨西哥一项针对PNPLA3 基因多态性与冠心病相关性的研究结果相一致[10]。PETTA 等[11]发现在携带PNPLA3 rs738409 GG 基因型的NAFLD 患者发生颈动脉粥样硬化的风险增高。另有一项欧洲大数据人群研究表明PNPLA3 rs738409 G 等位基因对冠心病有一定的保护作用[12]。该结论在德国人群中进一步得到证实,rs738409 G 等位基因与TC、LDL 水平呈负相关,与罹患冠心病的风险亦呈负相关[13]。
表3 PNPLA3 rs738409 基因型及等位基因的发病风险Tab.3 Correlation of PNPLA3 rs738409 genotype and allele with the risk of CAD
既往有研究表明PNPLA3 与ALT 水平显著相关,ALT 水平升高,心血管疾病患者病死率更高[14]。然而本研究PNPLA3 rs738409 G 等位基因非携带者与携带者在冠心病组、健康对照组的各自组内比较中,血脂、肝功能各项指标差异均无统计学意义。分析其原因可能为,本次研究对象仅限于青岛地区人群,考虑到不同种族地区人群的遗传背景差异较大,后续研究应在更多地区、更多人群中开展。
综上所述,目前国外关于PNPLA3 rs738409 多态性与冠心病相关性的研究整体偏少,且所得结论不一。本研究为国内关于PNPLA3 与冠心病相关性的首次探讨,但仍存在一定的不足。地域条件、样本数量等条件限制,以及部分确诊冠心病患者通过降脂药物进行临床干预,均可能在一定程度上影响了结果的准确性。尽管本研究所得结论是阴性的,但仍可为后续的研究提供参考。
表4 PNPLA3 rs738409 G 等位基因非携带者与携带者的临床特征比较Tab.4 Analysis of clinical characteristics in PNPLA3 rs738409 G allele carriers and non-carriers of the study population x±s