苦参-蛇床子药对提取物对白念珠菌VVC临床株的抑制作用研究

施高翔 姜晶晶 汪云霞 赵婷 邵菁 汪天明 汪长中,3

(1.安徽中医药大学 中西医结合学院；2.安徽省中医药科学院 中西医结合研究所；3.中药复方安徽省重点实验室，合肥 230012)

白念珠菌(Candidaalbicans，C.albicans)是常见的机会致病性真菌，常引起皮肤黏膜感染[1]。文献报道，近75%的女性一生中至少感染1次念珠菌，引起外阴阴道念珠菌病(vulvovaginalcandidiasis，VVC)[2-3]。目前，临床用于治疗VVC的抗真菌制剂种类有限，且表现出一定的毒副作用和耐药性[4-5]，使其在临床上的应用受到限制。

我国中药资源丰富，来源广泛。中药抗真菌感染的记载由来已久，目前从中药中筛选抗真菌药物并研究其作用机制已成为抗真菌药物研发领域的重要方向。通过大量文献调研并结合课题组近几年的药物筛选发现，苦参(SophoraflavescensAit.)、蛇床子(Cnidiummonnieri(L.) Cuss.)两味中药单用无显著抗真菌作用，但两者在临床上经常以药对形式在抗VVC的复方中配伍使用，两药在此类复方中使用频率排在前2位[6-7]。课题组前期实验表明，苦参与蛇床子两味药按1∶1比例所得水提物具有显著的抗真菌作用。本文着重考察苦参-蛇床子1∶1药对水提物(Extract ofSophoraeFlavescentisRadix—CnidiiFructuscouplet medicines，ESCC)对引发VVC的白念珠菌主要毒力因子即酵母-菌丝二相转换与生物膜形成的影响，为进一步探寻苦参-蛇床子药对抗真菌的机制研究奠定实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株 白念珠菌标准菌株C.albicansSC5314由第二军医大学姜远英教授惠赠；白念珠菌VVC临床株由安徽中医药大学第一附属医院皮肤性病科分离。

培养基和试剂 RPMI-1640培养基(life technologies公司)；沙氏固体、液体培养基(青岛海博生物技术有限公司)；超纯水(18.2Ω Milli-Q Gradient A10超纯水系统)；YPD培养基(青岛海博生物技术有限公司)；二甲基亚砜(Dimethyl Sulphoxide，国药集团)；戊二醛(国药集团)；PBS缓冲液(pH 7.0±2.0，实验室配制)；无水乙醇(天津市永大化学试剂有限公司)，石油醚(天津市华东试剂厂)，乙酸乙酯(江苏省强盛功能化学股份有限公司)，正丁醇(上海苏懿化学试剂有限公司)，XTT[2,3-Bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide][生工生物工程(上海)股份有限公司]。

仪器 聚苯乙烯96孔和6孔微量培养板(Corning公司，美国)；酶标仪(Thermo Fisher Labserv K3)；倒置荧光显微镜(Olympus IX81，日本)；恒温培养箱(博迅实业公司，上海)；DSX-280B 型手提式压力蒸汽灭菌器(申安医疗器械厂，上海)；流式细胞仪(Flow Cytometer，BD Accuri C6)。

药物 苦参、蛇床子购于安徽中医药大学第一附属医院中药房，并经方成武教授鉴定；氟康唑(Fluconazole，FLZ，博美生物科技)。

1.2 方法

苦参-蛇床子药对水提取物的制备 按照1∶1比例称取苦参和蛇床子单味药各20 g，加入10倍量蒸馏水浸泡过夜。接冷凝回流装置，加热套煮沸并保持沸腾2 h，回收提取液。重复以上操作3次并混合提取液，旋转蒸发浓缩至100mL，真空冷冻干燥成固体粉末得苦参-蛇床子1∶1药对水提取物(Extract ofSophoraeFlavescentisRadix—CnidiiFructusCouplet medicines，ESCC)，EP管封装低温保存备用。

白念珠菌悬液的制备 在超净工作台中，使用接种环挑取YPD平板上白念珠菌单菌落，移种至沙氏液体培养基中进行活化，37℃恒温箱中活化18～20 h，连续活化2次。以RPMI-1640培养基将菌液浓度调整成2×106CFU/mL和2×103CFU/mL备用。

酶标仪检测白念珠菌的MIC80利用微量液基稀释法[8]检测ESCC对白念珠菌VVC临床株的MIC80。实验称取ESCC冻干粉，用RPMI-1640配制终浓度为2048、1024、512、256、128、64、32、16、8、4 μg/mL的提取物药液。将不同浓度的ESCC药液和菌液(2×103CFU/mL)各100 μL加入96孔微量培养板，另设阳性对照组(2 μg/mL FLZ +菌液)和空白对照(不含任何药液)。37℃恒温箱中孵育24h。用多功能酶标仪于600nm波长处检测吸光度(optical density，OD)值。相比于空白组，以吸光度减少为空白组80%的药物稀释度为MIC80。

XTT法检测白念珠菌细胞的增殖活性 实验采用XTT法考察ESCC对白念珠菌VVC临床株细胞增殖活性的影响[9]。实验将ESCC干粉以RPMI-1640配制终浓度为8～4096 μg/mL。将不同浓度ESCC药液和菌液(2×106CFU/mL)各100 μL加入96孔微量培养板，另设阳性对照组(32 μg/mL FLZ +菌液)和空白对照组(不含任何药液)，37℃恒温箱中孵育24 h。

配制XTT溶液并滤过除菌，临用前加入维生素K3(2 μmol/L)配制成XTT-VK3。96孔板每孔加入50 μL XTT-VK3，37℃恒温箱继续避光孵育2 h，以多功能酶标仪于492 nm波长处检测OD值。

正断层是常见的断层形式，指断层上盘在重力或水平张力作用下沿着断层面向下运动。当周围土质硬度较低，管子在正断层斜拉作用下易发生拉伸破坏。该项研究利用ADINA有限元软件模拟管子在正断层位移错动及管道内压共同作用下的破坏变形，以此来研究不同内压对输液管道抗震性能的影响。

倒置显微镜观察白念珠菌酵母-菌丝二相转换 配制不同浓度ESCC(256、512、1024 μg/mL)与白念珠菌VVC临床株菌悬液(2×106CFU/mL)各3 mL加入12孔板，另设阳性对照组(32 μg/mL FLZ+菌液)和空白对照组(不含任何药液)，37℃恒温培养4、8、12 h，置于倒置显微镜下观察白念珠菌VVC临床株酵母相和菌丝相生长情况，并拍照。

扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscopy，SEM)观察白念珠菌生物膜的形态结构 将盖玻片(75%酒精过夜预处理)放入 6 孔培养板中，加入不同浓度ESCC(256、512、1024 μg/mL)，与白念珠菌VVC临床株菌悬液(2×106CFU/mL)共孵育，设阳性对照组(32 μg/mL FLZ+菌液)和空白对照组(不含任何药液)，37℃恒温培养24 h后以无菌 PBS 缓冲液轻洗玻片上未黏附菌体，放入预冷的2.5%戊二醛固定2 h，以30%、50%、70%、90%和无水乙醇逐级脱水各20 min，室温干燥后，经HVS-GB 型真空蒸镀仪喷金，扫描电镜观察并拍照[10]。

微孔板观察白念珠菌成熟生物膜的生长 取玻片至于75%乙醇溶液中浸泡24 h，取出后用无菌PBS洗净置于6孔板中，将RPMI-1640培养基与同体积白念珠菌VVC临床株菌液(浓度为2×106CFU/mL)依次加入6孔微量培养板中混合，放入37℃恒温箱中培养24 h，待白念珠菌生物膜形成后加药干预。实验分别设空白对照组(不含任何药液)、阴性对照组(只含RPMI-1640培养基)，阳性对照组(1024 μg/mL FLZ)、不同浓度ESCC干预组(2048、1024、512 μg/mL)，37℃恒温培养24 h，观察ESCC对白念珠菌VVC临床株成熟生物膜的影响。

qRT-PCR 检测白念珠菌菌丝、生物膜相关基因转录水平 苦参-蛇床子1∶1药对水提物(256、512、1024 μg/mL)干预白念珠菌VVC临床株后，5000 r/min离心5 min收集菌体，参照Mag Extractor-RNA试剂盒说明书提取总RNA。依逆转录试剂盒说明书，将提取的总RNA反转录成cDNA。采用qRT-PCR仪进行扩增，按 SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂盒，预变性(95℃/60 s)后，设置反应条件为：变性(95℃/15 s)→退火(55℃/15 s)→延伸(72℃/45 s)，40循环。基因转录水平用倍数变化(Relative Fold Change)来表示(2-ΔΔCt法)[11]。

据NCBI基因库查得基因序列，并用Primer Premier 5.0软件设计引物，委托上海生工生物工程有限公司合成引物(见表1)。

1.3 数据分析

2 结 果

2.1 苦参-蛇床子药对水提物对白念珠菌的MIC80

通过检测苦参-蛇床子药对水提物对白念珠菌浮游菌的的最低抑菌浓度(MIC)，ESCC抗VVC临床耐药白念珠菌效果显著，介于512～1024 μg/mL之间(见表2)。

2.2 苦参-蛇床子药对水提物可影响白念珠菌细胞的增殖活性

表1 菌丝和生物膜相关基因引物序列表

表2 ESCC对白念珠菌的MIC80(μg/mL)

图1XTT法检测ESCC对白念珠菌代谢活性的影响(*P<0.05，**P<0.01)

Fig.1The effect of ESCC on the metabolic activityC.albicans(*P<0.05，**P<0.01)

2.3 苦参-蛇床子药对水提物可影响白念珠菌酵母-菌丝二相性转换

实验将ESCC和白念珠菌VVC临床株共培养4h、8h、12h后，通过倒置显微镜观察发现，空白对照组有菌丝相和酵母相交织形成的生物膜。而加药组，随着ESCC浓度的增加，菌丝形成较少，菌体数量也逐渐减少。其中当ESCC浓度为1024μg/mL时菌体数量明显减少，且只见有酵母相菌体，几乎无菌丝形成(见图2)。

2.4 苦参-蛇床子药对水提物可影响白念珠菌生物膜的形态结构

通过SEM观察发现，空白组白念珠菌VVC临床株酵母-菌丝相互交织，包裹着细胞外基质，形成三维立体的生物膜结构，但经不同浓度ESCC干预后，酵母相和菌丝相均不同程度减少，其中1024 μg/mL水提物组可抑制白念珠菌生物膜的形成(见图3)。

2.5 苦参-蛇床子药对水提物可破坏白念珠菌成熟生物膜的完整性

实验将ESCC加入预先培养成熟的白念珠菌VVC临床株生物膜中，观察其对白念珠菌成熟生物膜的影响。结果如图4显示，空白对照组(图4A/a)中白念珠菌形成致密的生物膜，而加入ESCC干预24h后(图4D/d、E/e、F/f)，抑制了白念珠菌生物膜的形成，且随药对提取物浓度的增加，白念珠菌成熟生物膜的完整性受到严重破坏。

2.6 苦参-蛇床子药对水提物可影响白念珠菌菌丝和生物膜相关基因转录水平

通过qRT-PCR检测，结果发现相比于内参基因，白念珠菌VVC临床株经ESCC(256、512、1024 μg/mL)干预后，可降低菌丝和生物膜形成相关基因的转录水平。其中1024 μg/mL药对水提物影响最为明显，分别使ALS1、ALS3、HWP1下调78.12%、85.73%、84.92%(见图5)。

3 讨 论

由白念珠菌引起的外阴阴道念珠菌病是困扰女性的常见病，影响女性的身体健康和生活质量[12]。而临床常见治疗药物如氟康唑、酮康唑等的广泛使用甚至滥用，已致出现大量白念珠菌耐药菌株[13]，极大限制了VVC的治疗。

近些年，中医药治疗VVC越发受到学者们的关注。药对是方剂中最小的配伍形式，是中医药学家在遣方用药中的经验凝练，体现中药方剂的规律特征与辩证施治的内涵[14-15]。中医认为VVC多是由湿、热、虫三邪所致[16]。临床常用复方苦参洗剂和苦参蛇床子栓剂等均是以苦参、蛇床子等为主要药物，用于治疗VVC，发挥清热燥湿、杀虫利尿、泻火解毒等功效[17-19]。文献报道[20-22]苦参有效成分(苦参碱和氧化苦参碱)与蛇床子提取物单用时抗白念珠菌效果较差，二者联用即可大大增加抗菌效应，且对阴道炎治疗效果显著。

实验通过微量液基稀释法检测发现苦参-蛇床子1∶1药对水提物(ESCC)具有一定的抗真菌效果，XTT实验结果也表明，药对水提物可剂量依赖性的降低白念珠菌VVC临床株细胞的增殖活性。

图2倒置显微镜观察ESCC对白念珠菌酵母-菌丝二相性转换的影响(×400)图3ESCC对白念珠菌生物膜形态结构的影响(1500×).A.空白对照组；B.阳性对照组(32 μg/mL FLZ)；C.1024 μg/mL ESCC组；D.512 μg/mL ESCC组;E.256 μg/mL ESCC组图4ESCC对白念珠菌成熟生物膜的影响(200×).A(a).2048μg/mL ESCC组；B(b). 1024 μg/mL ESCC组；C(c). 512 μg/mL ESCC组；D(d). RPMI-1640培养基组；E(e). 空白对照组；F(f). 阳性对照组(FLZ:1024 μg/mL)

Fig.2Effects of ESCC on yeast-hypha conversion ofC.albicans(×400)Fig.3The effect of ESCC on the morphology ofC.albicansbiofilms(1500×).A.Control;B.positive control group (32 μg/mL FLZ);C.1024 μg/mL ESCC;D.512 μg/mL ESCC;E.256 μg/mL ESCCFig.4The effect of ESCC onC.albicansmature biofilms(200×).A(a).2048μg/mL ESCC; B(b). 1024 μg/mL ESCC; C(c). 512 μg/mL ESCC; D(d). RPMI-1640 medium; E(e). Control; F(f). positive control group(FLZ:1024 μg/mL)

图5ESCC对白念珠菌菌丝、生物膜相关基因转录水平的影响(*P<0.05，**P<0.01)

Fig.5Effects of ESCC on the expression ofC.albicanshypha and biofilms-related genes(*P<0.05,**P<0.01)

在实验观察中发现ESCC在早期对白念珠菌VVC临床株的抑制作用显著，而白念珠菌生长周期的早期正是酵母-菌丝二相型转换的重要阶段[23]。本实验设计观察4 h、8 h、12 h三个时间段，ESCC对白念珠菌的抑制作用。倒置显微镜观察结果显示，白念珠菌在4～12 h为菌丝生长期，空白组可见大量菌丝，但药对水提物不同浓度组可显著抑制菌丝的形成，提示ESCC的抗真菌作用可能是与抑制白念珠菌的主要毒力因子即酵母-菌丝二相转换有关。

菌丝的形成，一方面可大大增强菌体的黏附性[23]，另一方面也是白念珠菌生物膜的形成重要组成部分[24]。生物膜是由白念珠菌生长过程中分泌到菌体外的细胞外基质包裹酵母相和菌丝相形成的致密的三维立体结构，可明显增强白念珠菌的毒力和致病性。扫描电子显微镜实验结果表明，空白组形成酵母与菌丝交织的致密的生物膜结构，但经ESCC干预后，生物膜结构不典型，菌体数量显著减少，且菌丝形成较少。提示ESCC可影响白念珠菌的生物膜的形成。

实验还设计观察了ESCC对白念珠菌成熟生物膜的影响。实验通过预先在玻片上培养成熟的生物膜，加药物干预后结果发现，相比于空白组的致密生物膜结构，不同浓度加药组均可破坏成熟生物膜的完整性，导致生物膜松散，从玻片上脱落。

目前认为，ALS1、ALS3、HWP1编码产物与菌丝及生物膜形成密切相关，被敲除或抑制将导致酵母-菌丝形态转化受抑制，毒力随之下降[25-27]。为了从基因水平找寻ESCC抗真菌机理，实验通过qRT-PCR检测白念珠菌VVC临床株的菌丝、生物膜形成相关基因的转录水平。本实验结果发现经ESCC干预后，ALS1、ALS3、HWP1基因转录水平均有明显下调趋势，提示ESCC可影响菌丝、生物膜形成相关基因的表达，降低其转录水平和编码产物。

综上，苦参-蛇床子1∶1药对水提物的抗真菌活性可能是通过影响白念珠菌菌丝及生物膜形成相关基因，进而使其编码的相关产物降低，影响酵母-菌丝二相转化，以及生物膜的形成，从而起到抗白念珠菌作用。