高通量测序诊断多重真菌与细菌感染所致重症肺炎1例

王桂祯 吕迪 庄育刚 彭沪

(同济大学附属第十人民医院急诊科，上海 200072)

重症肺炎是由病原体入侵引起的严重肺部感染，其起病隐匿、临床症状不典型、病情进展迅速，具有较高的患病率和病死率。临床最常见的肺炎病原体为细菌和病毒，而真菌及多重感染相对少见，早期病原学诊断较困难。现报道1例应用高通量测序辅助诊断的多重真菌与细菌感染性重症肺炎。

1 临床资料

患者，男性，67岁。因咳嗽咳痰伴发热1周，胸闷2 d入住我院急诊ICU。患者入院前1周受凉后出现咳嗽咳痰(黄脓痰)，伴发热，最高体温39℃，自服日夜百服宁、阿奇霉素等药物病情仍不断加重；2 d前出现胸闷气急，伴明显乏力；1 d前突然摔倒在地，无明显意识障碍，紧急送至我院抢救室。病程中，患者神志欠清，精神萎靡，大便未解，小便量可。既往2型糖尿病病史2年(降糖药物、血糖控制不详)；慢性阻塞性肺病病史多年；数年前有胃溃疡出血史；吸烟史35年；余无殊。

入院查体：体温39℃，心律96次/min，呼吸22次/min，血压145/80 mmHg，镇静镇痛状态。皮肤巩膜无黄染，双侧瞳孔光反射灵敏，胸廓无畸形，肋间隙正常。双肺呼吸音粗，可听及明显湿啰音及喘鸣音，未及胸膜摩擦音。心律齐，各瓣膜区未及异常心音及杂音。腹部软，未及明显包块，听诊肠鸣音存在(3次/min)。双下肢无水肿，足背动脉搏动可。病理征未引出。

入院检查：急査血常规示超敏C-反应蛋白>200 mg/L，白细胞 10.57×109/L，中性粒细胞百分比 96.5%；血生化示降钙素原56.07 ng/mL，总蛋白 47g/L，白蛋白 23 g/L，肌酐 63.9 ummol/L，尿素氮 10 mmol/L，糖化血红蛋白13.1%，血糖 25 mmol/L，血酮体5.6 mmol/L；血气分析示PH 7.38，PaO252 mmHg，PaCO230 mmHg；心肌酶谱、凝血功能、肿瘤标志物、系列病毒抗体、自身抗体、体液免疫等检查基本正常。胸部CT示两肺多发炎症(见图1)。并立即送检痰培养、血培养、痰液病原高通量基因检测寻找微生物证据。

诊断：重症肺炎、慢性阻塞性肺病、2型糖尿病酮症。

治疗：入院后呼吸机辅助通气，予以经验性莫西沙星联合亚胺培南、西司他丁抗感染，补液、降糖、化痰等对症支持治疗。入院第3天患者血清G试验示血D-葡聚糖134.5 pg/mL，痰涂片检出革兰阴性杆菌、真菌菌丝及孢子，痰培养示白念珠菌；痰液病原高通量测序示肺炎链球菌、假肺炎链球菌、埃及嗜血杆菌、白念珠菌、烟曲霉等阳性(见表1)。随即调整抗生素方案为利奈唑胺、替加环素联合伏立康唑。并再次留取痰培养，示鲍曼不动杆菌，继续原有抗感染治疗方案。入院第14天患者体温恢复正常，神志恢复，病情好转，血常规及生化示白细胞 6.33×109/L，超敏C-反应蛋白 6.27 mg/L，降钙素原0.39 ng/mL，D-葡聚糖正常。入院第23天患者病愈出院。

图1肺部CT检查。入院肺部CT片示两肺散在片状高密度影，密度较均匀，部分边缘模糊，提示“重症肺炎”。

Fig.1Pulmonary CT scan. The CT images showed multiple high-density shadow scattered in both lungs. The lesions had uniform density, and some displayed hazy border, suggesting severe pneumonia.

表1痰液高通量测序

Tab.1Microbial test of sputum with high throughput sequencing technology

序号检出病原体(属)检出病原体(种)检出序列数备 注1链球菌属(G+)肺炎链球菌2363鼻咽正常菌,可致肺炎等感染2链球菌属(G+)假肺炎链球菌77与COPD及呼吸道感染有关3乳杆菌属(G-)唾液乳杆菌38消化道原生菌4乳杆菌属(G-)格氏乳杆菌4消化道益生菌5嗜血杆菌属(G-)埃及嗜血杆菌4急性化脓性结膜炎相关病原菌6假丝酵母属白念珠菌11粘膜定植真菌,可引起机会性感染7曲霉属烟曲霉4条件致病真菌

注：G，革兰氏染色。

2 讨 论

重症肺炎是临床最重要的感染性疾病之一，可表现为咳嗽、咳痰、发热、心慌、呼吸困难等症状，易并发呼吸衰竭、水电解质和酸碱失衡以及其他系统并发症，是导致肺炎患者死亡的首要病因[1-2]。随着人口老龄化进程加快、环境污染以及临床不合理用药等因素的共同影响，近年来我国重症肺炎的患病率呈逐年上升的趋势。

重症肺炎可由细菌、病毒、真菌等多种不同病原体侵犯机体而发生，其病原谱因地域分布和宿主易感因素而不同。王新卫等报道我国老年重症肺炎痰液分离病原菌主要以革兰阴性菌为主(约66%)，其中尤以鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌常见，白念珠菌等真菌感染以及多重感染少见。国外学者报道多重微生物感染在社区获得性肺炎患者中约占6%～13%，其中以两种细菌感染或一种细菌合并另一种非典型病原体感染多见[3-4]。然而，由于现有微生物检测技术敏感性和临床样本获取的限制，多重病原体肺部感染的真实患病率尚不可知，极可能被低估[5]。本病例中，我们应用高通量测序技术诊断了1例少见的多重真菌与细菌感染性重症肺炎。

重症肺炎临床防控的关键在于明确致病的病原体。侵袭性真菌感染发病率比细菌病原体相对较低，临床表现无特异性，通常缺乏早期、特异性的诊断技术，易为临床医生所忽视。当前，临床标本的病理活检、真菌镜检/培养仍然是多种侵袭性真菌病的诊断金标准，然而病原体的分离与鉴定费时费力，且阳性率低；血清学检测也是侵袭性真菌感染的重要诊断方法，然而其影响因素较多，存在一定的假阳性与假阴性[6]。本病例中，患者痰液真菌镜检与血清G试验均为阳性，提示存在侵袭性真菌感染，然而无法判断明确的致病病原体；痰培养示白念珠菌，无法排除病原体定植，对抗真菌治疗开展有诸多掣肘因素。在此基础上，我们应用高通量测序技术从患者痰液标本中成功检测出白念珠菌、曲霉菌、肺炎链球菌、埃及嗜血杆菌等多种真菌与细菌病原体，为患者的早期病原学诊断及治疗方案选择提供了重要的依据。

近年来，分子生物学技术的进步尤其是高通量病原筛查技术的快速发展，为各种侵袭性病原体的检测与鉴定提供了快速、高效的途径[7]。这些新兴技术如基于保守序列的PCR、限制性片段长度多态性分析、基因芯片等已成功应用于病原体的筛查，但存在实验操作繁琐、检测敏感度低、耗时费力等缺点。高通量测序技术，其原理在于对临床样本中所有DNA或RNA无选择性分析，建立相关序列数据库，通过同源序列比对以筛查鉴定病原体。这种方法不需要病原体的分离培养即可实现快速检测，不仅有效克服了现有分子诊断技术的缺陷，还为多种混合感染病原体(尤其是真菌和病毒)的检测开辟了新的技术路径[8]。本病例中，我们应用高通量测序技术从患者痰液中检测出所有潜在的致病病原体，其灵敏度与时效性显著优于病原体的分离培养。然而，目前高通量测序病原筛查技术费用较高，且仍无法区分临床样本中阳性微生物究竟是定植菌还是病原体，如本例患者痰液中的白念珠菌及乳杆菌。因此，解读高通量测序结果仍需结合临床表现、病原学与生化检测，方可提供更为精准的临床诊断。

本文综合应用高通量测序等多种方法，使本例多重真菌与细菌肺部感染成功获得了早期病原学诊断。以此为基础，在入院早期就及时调整了相应的抗感染方案，2周后患者病情显著好转，血常规、C-反应蛋白及D-葡聚糖等恢复正常。尽管早期诊断无法防止侵袭性感染的发生，但可为患者在重症肺炎及其并发症无法逆转之前获得及时精准干预的时间，从而最大限度地降低病死病残率。高通量测序可用于肺部多重感染的早期病原学诊断，为少见病原体的筛查与鉴定提供快速高效的技术手段。