白芥子涂方乳化型膏贴剂的制备工艺

刘新国，黄文涛

(武汉市第一医院药学部，武汉 430022)

白芥子涂方用于防治肺系疾病，始见于清代张璐编撰的《张氏医通》，该方在防治哮喘方面有较好疗效，目前被各大医院广泛采用[1]。传统白芥子涂方以药材粉末入药，不仅成分含量不可控，且由于药材本身质量差异以及患者皮肤耐受程度差别，使得贴敷时间一般只能维持2～6 h[2-3]，有悖于经皮给药制剂质量可控、缓释长效的要求。目前，笔者尚未见基于该方开发的现代膏贴剂型。笔者在系统比较软膏剂、黑膏药等膏贴剂型特点基础上，配制具有乳化性质的硬膏剂基质。该基质与其他外用膏贴基质相比，在载药量、乳化性能、药物兼容性、透皮能力、稳定性方面均具有明显优势。笔者在研究中首先采用乙醇回流提取与现代超临界二氧化碳(CO2)萃取技术实现药材有效成分的浓度富集与纯化，再结合乳化型膏贴透皮剂型，将此传统经典方药开发成治疗哮喘的新型中药膏贴剂型，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器 SPD-10A型二元泵高效液相色谱仪，配Essentia SPD-16型紫外检测器(岛津公司)； ME215s型分析天平(Sartorious公司，感量：0.01 mg)；HS6510D型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药 芥子碱硫氰酸盐对照品(批号：111702-201303，含量：98.3%)、大戟二烯醇对照品(批号：111866-201302，含量：99.9%)、细辛酯素对照品(批号：111889-201203，含量：100%)、延胡索乙素对照品(批号：0726-200208，含量：99.8%)均购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯(美国Tedia试剂公司生产，批号：16095012)。水为纯净水，其他试剂均为市售分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件

2.1.1芥子碱硫氰酸盐含量测定色谱条件 色谱柱：Zorbax Extend C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.08 mol·L-1磷酸二氢钾(10：90)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：326 nm；进样量：10 μL；柱温：30 ℃，理论塔板数按芥子碱峰计算应不低于3000。

2.1.2大戟二烯醇含量测定色谱条件 色谱柱：Zorbax Extend C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(95：5)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：210 nm；进样量：10 μL；柱温：30 ℃，理论板数按大戟二烯醇峰计算应不低于6000。

2.1.3细辛脂素测定色谱条件 色谱柱：Zorbax Extend C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.2%醋酸溶液(48：52)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：287 nm；进样量：10 μL；柱温：室温，理论板数按细辛脂素峰计算应不低于3000[4]。

2.1.4延胡索乙素测定色谱条件 色谱柱：Zorbax Extend C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(40：60)，用三乙胺调pH值6.5；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：280 nm；进样量：10 μL；柱温：30 ℃，理论板数按延胡索乙素峰计算应不低于3000[5]。

2.2溶液的配制

2.2.1对照品贮备溶液的制备 精密称取经五氧化二磷干燥至恒重的芥子碱硫氰酸盐对照品、大戟二烯醇对照品各适量，分别置于不同量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别制成芥子碱硫氰酸盐496 μg·mL-1和大戟二烯醇163 μg·mL-1对照品贮备溶液。

2.2.2供试品溶液的制备 精密量取各回流提取样品1 mL，甲醇定容至5 mL量瓶，摇匀，以孔径0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性对照溶液的制备 取除受试药材以外的药材，按回流提取方法操作，精密量取提取液样品1 mL，甲醇定容至5 mL量瓶，摇匀，以孔径0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即为阴性对照溶液。

2.3方法学考察

2.3.1方法专属性考察 吸取供试品溶液、阴性对照溶液、芥子碱硫氰酸盐和大戟二烯醇对照品溶液各10 μL，按“2.1”项色谱条件进行液相分析，见图1。

2.3.2标准曲线的绘制 精密量取上述对照品贮备溶液100，200，400，1000，2000 μL，加甲醇稀释定容至10 mL，分别精密吸取10 μL注入液相色谱仪，按照上述色谱条件平行进样测定3次。以芥子碱硫氰酸盐、大戟二烯醇进样量(ng)为横坐标(X)，峰面积平均值为纵坐标(Y)进行线性回归，得回归方程，结果见表1。

2.3.3精密度实验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，按“2.1”项色谱条件连续进样5次，测得芥子碱硫氰酸盐和大戟二烯醇峰面积的RSD分别为0.28%和0.93%，表明仪器精密度良好。

2.3.4稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别于0，2，4，6，12 h进样测定。经计算，芥子碱硫氰酸盐和大戟二烯醇峰面积的RSD分别为1.12%和1.57%，表明供试品溶液在12 h内基本保持稳定。

2.3.5回收率实验 精密称取9份已知含量的回流提取液200 μL，分别向其中加入一定量芥子碱硫氰酸盐或大戟二烯醇对照品，用流动相加至5 mL，混匀，精密吸取10 μL注入液相色谱仪，测定峰面积。利用标准曲线计算含量，以3次平行进样的平均含量计算加样回收率，结果芥子碱硫氰酸盐平均回收率97.06%，RSD=2.40%，大戟二烯醇平均回收费率96.66%，RSD=2.31%。见表2。

2.4白芥子、甘遂回流提取工艺的正交实验设计 白芥子、甘遂药材乙醇回流提取工艺，以白芥子有效成分芥子碱硫氰酸盐和甘遂有效成分大戟二烯醇的提取量作为考察指标，采用《中华人民共和国药典》2015年版芥子和甘遂药材品种项下高效液相色谱(HPLC)法测定相关指标成分含量[5]。以乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数为影响因素，选用L9(34)表进行正交实验，优选回流提取工艺条件。正交实验因素水平设计见表3。

A.芥子碱硫氰酸盐对照品溶液；B.供试品溶液；C.缺芥子的阴性对照品溶液；D.大戟二烯醇对照品溶液；E.供试品溶液；F.缺甘遂的阴性对照品溶液；1.芥子碱硫氰酸盐；2.大戟二烯醇

图1 回流提取样品的高效液相色谱图

A.sinapine thiocyanate；B.sample solution; C.mustard negative control; D.euphadienol; E.sample solution;F.euphorbia negative control；1.sinapine thiocyanate control；2.euphadienol

Fig.1Highperformanceliquidchromatographforrefluxingsamples

表1 芥子碱硫氰酸盐与大戟二烯醇线性关系考察

Tab.1Linearcorrelationofsinapinethiocyanateandeuphadienol

成分线性方程r线性范围/ng芥子碱硫氰酸盐Y=7534.6X-25 9880.999 849.2～992大戟二烯醇Y=37 652X-22 3970.999 916.3～326

表2 芥子碱硫氰酸盐与大戟二烯醇回收率实验结果

Tab.2Experimentalresultsontherecoveryofsinapinethiocyanateandeuphadienol

成分样品量加入量测得量μg回收率/%芥子碱硫氰酸盐97.874.4166.392.0797.874.4168.795.3097.874.4168.194.4997.899.2195.498.3997.899.2194.497.3897.899.2193.696.5797.8124.0220.298.7197.8124.0219.197.8297.8124.0220.899.19大戟二烯醇24.916.340.394.4824.916.340.796.9324.916.340.998.1624.924.547.692.6524.924.548.696.7324.924.549.299.1824.932.657.198.7724.932.657.399.3924.932.656.697.24

表3 回流提取工艺正交实验因素水平

Tab.3Factorsandlevelsoforthogonalexperimentforrefluxextractionprocess

水平乙醇浓度(A)/%提取时间(B)/min溶剂用量(C)/mV提取次数(D)16060 17127590 1102390120 1133

2.5细辛和延胡索超临界CO2萃取工艺正交实验设计 细辛和延胡索超临界CO2萃取工艺是以延胡索中延胡索乙素以及细辛中细辛酯素提取量为考察指标，采用《中华人民共和国药典》2015年版细辛和延胡索药材品种项下HPLC法测定相关指标成分含量[5]。以萃取压力、萃取温度、夹带剂用量、萃取时间为影响因素，选用L9(34)表进行正交实验，优选超临界CO2萃取工艺条件。正交实验因素水平设计见表4。

表4 超临界CO2萃取工艺正交实验因素水平表

Tab.4FactorsandlevelsoforthogonalexperimentforsupercriticalCO2extractionprocess

水平萃取压力(A)/MPa萃取温度(B)/℃夹带剂用量(C)/倍萃取时间(D)/min115401.560225503.090335604.5120

2.6乳化型膏贴基质配方的正交实验设计 成型工艺采用石蜡、单甘酯、凡士林、甘油为中药膏贴剂型基质配料，选择黏性、软硬度、熔化性、均匀度等为考察指标进行综合评分，采用L9(34)正交实验优选基质配制比例，正交实验因素水平设计见表5。

表5 基质配比正交实验设计表

Tab.5Orthogonaldesignofmatrixratio

g

按膏贴基质配比正交实验设计表实验，将制成的药膏制成圆柱状，再切成圆片状，将药膏填充入背衬层的固定圆环中，使每张膏贴中填充药膏2 g，直径约3.6 cm，含生药材4 g。以下是正交实验基质评分的标准。①黏性。4分：适中，不粘手；2分：黏性偏强或偏差；0分：无黏性或粘手。②软硬度。4分：适中，易成形，易压成片状；2分：较易成形，但偏硬或偏软；0分：太硬或太软，不易成形。③均匀度(肉眼观察)。4分：颜色均匀一致；2分：比较均匀，但浸膏与基质混合略显不均匀；0分：浸膏与基质混合不均匀。④熔化性(45～50 ℃考察48 h)。4分：制成贴剂后，放置恒温45～50 ℃烘箱中观察48 h，基质不熔化，底衬垫上未见明显熔化痕迹<1 mm；2分：基质少量熔化，底衬垫上熔化痕迹1～2.5 mm；0分：基质熔化明显，底衬垫上熔化痕迹>2.5 mm。⑤载药量。4分：20%以上；3分：15～20%；2分：10～15%；1分：10%以下。

2.7白芥子和甘遂回流提取的正交实验结果 按表1设计方案分别进行回流提取，滤过，测定其中芥子碱硫氰酸盐和大戟二烯醇含量，正交实验结果见表6，各指标成分方差分析结果见表7，8。

结果显示，仅乙醇浓度对白芥子和甘遂提取效果产生显著影响(P<0.05)，高浓度乙醇不利于芥子碱溶出。而对于甘遂的提取而言，溶剂用量是影响结果的首要因素(P<0.05)，适当提高乙醇浓度可以增加大戟二烯醇的溶出。如果考虑将两种药材进行合并提取，综合省时、经济方面的因素考虑，则应选择乙醇回流提取工艺条件为加13倍量60%乙醇，回流提取1次，每次1 h。

2.8细辛和延胡索超临界CO2萃取正交实验结果 按表2设计方案分别进行超临界CO2萃取，测定样品中细辛脂素和延胡索乙素含量，正交实验结果见表9，各指标成分方差分析结果分别见表10，11。

表6 白芥子和甘遂乙醇回流提取正交实验结果

Tab.6Orthogonalexperimentresultsofethanolrefluxextractionofwhitemustardseedandeuphorbia

序号因素石蜡(A)单甘酯(B)凡士林(C)甘油(D)芥子碱硫氰酸盐大戟二烯醇(μg·mL-1)11111543.1120.021222488.8124.431333489.6128.842123484.7150.752231471.4153.662312448.1146.573132424.3143.583213410.6131.193321393.4138.0K11 521.481 452.031 401.721 407.86K2404.181 370.801 366.881 361.23K31 228.231 331.051 385.281 384.79R293.25120.9834.8546.63K1373.13414.13397.52411.60K2450.77409.12413.10414.32K3412.59413.24425.86410.57R77.655.0128.343.74

表7 白芥子乙醇回流提取方差分析结果

Tab.7Resultsofvarianceanalysisonethanolrefluxextractionofwhitemustardseed

误差来源离差平方和自由度方差F值P值石蜡(A)14 523.992.007 262.0071.69<0.05单甘酯(B)2 535.002.001 267.5012.51>0.05凡士林(C)202.602.00101.301.00>0.05甘油(D)362.342.00181.171.79>0.05

F0.05(2，2)=19.00，F0.01(2，2)=99.00

表8 甘遂乙醇回流提取方差分析结果

Tab.8Resultsofvarianceanalysisonethanolrefluxextractionofeuphorbia

误差来源离差平方和自由度方差F值P值石蜡(A)1 004.972.00502.48403.20<0.01单甘酯(B)4.772.002.381.91>0.05凡士林(C)134.272.0067.1453.87<0.05甘油(D)2.492.001.251.00>0.05

F0.05(2，2)=19.00，F0.01(2，2)=99.00

以细辛脂素含量为评价指标，由直观分析极差R可知影响超临界CO2的因素大小顺序为：A>B>D>C，优选条件为A2B1C2D1；以延胡索乙素含量为评价指标，由直观分析极差R可知影响回流的因素大小顺序为A>D>C>B，选择A2B2C2D3；从表8和表9结果可以看出，仅萃取釜压力对延胡索和细辛的提取效果产生显著影响(P<0.05)。综合两项实验结果，确定超临界CO2萃取优选工艺条件为：萃取压力25 Mpa，萃取温度40 ℃，95%乙醇为夹带剂，其用量为药材用量的3倍。

表9 细辛和延胡索超临界CO2萃取正交实验结果

Tab.9OrthogonalexperimentresultsofsupercriticalCO2extractionprocessofasarumandcorydalis

序号因素石蜡(A)单甘酯(B)凡士林(C)甘油(D)细辛脂素延胡索乙素(μg·mL-1)1111150.040.12122241.841.53133339.242.64212376.257.95223168.553.86231266.152.17313260.443.28321363.150.29332162.647.7K1131.06186.61179.14181.20K2210.86173.44180.71168.26K3186.08167.96168.16178.56R79.7918.6412.5512.94K1124.14141.04142.25141.53K2163.74145.54147.08136.77K3141.07142.38139.62150.65R39.614.507.4613.87

表10 细辛超临界CO2萃取的方差分析结果

Tab.10ResultsofvarianceanalysisonsupercriticalCO2extractionprocessofasarum

误差来源离差平方和自由度方差F值P值石蜡(A)1111.972.00555.9935.68<0.05单甘酯(B)61.222.0030.611.96>0.05凡士林(C)31.182.0015.591.00>0.05甘油(D)31.172.0015.581.00

F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.00

表11 延胡索超临界CO2萃取的方差分析结果

Tab.11ResultsofvarianceanalysisonsupercriticalCO2extractionprocessofcorydalis

误差来源离差平方和自由度方差F值P值石蜡(A)263.272.00131.6374.01<0.05单甘酯(B)3.562.001.781.00凡士林(C)9.552.004.772.68>0.05甘油(D)33.132.0016.579.31>0.05

F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.00

2.9乳化型膏贴基质配比的正交实验结果 乳化型膏贴基质配比的正交实验结果见表12，13，综合评分方差分析结果见表14。

表12 乳化型膏贴基质配比的正交实验结果

Tab.12Orthogonalexperimentresultsofmatrixratioofemulsionpaste

序号石蜡(A)单甘酯(B)凡士林(C)甘油(D)g综合评分12211142242216328331044223145443112648121476232886413109682112K140363838K240384238K330363034R102124

表13 基质配比正交实验综合评分计算

Tab.13Comprehensivescoresoforthogonalexperimentonmatrixratio

实验号软硬度黏性均匀度熔化性综合评分14(适中)2(太黏)441424(适中)4(适中)441632(太软)2(不黏)241042(偏软)4(适中)441452(偏软)2(太黏)441264(适中)4(适中)241472(偏软)2(太黏)22882(偏硬)2(不黏)241092(偏软)2(太黏)4412

表14 基质配比正交实验的方差分析结果

Tab.14Resultsofvarianceanalysisonorthogonalexperimentofmatrixratio

误差来源离差平方和自由度方差F值P值石蜡(A)22.222.0011.1125.00<0.05单甘酯(B)0.892.000.441.00凡士林(C)24.892.0012.4428.00<0.05甘油(D)3.562.001.781.00>0.05

F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.00

由表12，14结果可知，石蜡与凡士林用量是影响基质成型的关键因素，直观分析极差R显示影响因素大小顺序为C>A>D>B，优选配比为A1B2C2D1，即将石蜡2 g，单甘酯4 g，凡士林2 g分别加热熔化后，与甘油1 g混合均匀制成乳化型膏贴基质。

2.10乳化型膏贴剂型的体外经皮渗透实验 笔者在本研究前期将白芥子涂方药材提取物制备为高含水量的巴布凝胶剂型[4]，并利用改良Franze透皮扩散装置，进行了两种基质类型膏贴剂的离体大鼠皮肤透皮比较实验，结果见图2。从研究结果可以看出，对于细辛酯素和延胡索乙素两项透皮指标，乳化型膏贴的累积渗透量均明显高于巴布凝胶剂型，这可能是由于前者具有较高的载药量以及较好的皮肤角质层亲和能力与水化作用。

3 讨论

白芥子涂方穴位敷贴以原粉入药，不仅有效成分含量低，而且不利于质量控制，笔者在本研究采用超临界CO2萃取技术对目标成分进行选择性高效提取[4]，并采用HPLC法对其含量进行控制，制备出具有乳化性质的硬膏剂型。该剂型与其他外用膏贴剂相比在载药量、熔化性、均匀性、乳化性能、透皮性能方面具有显著特点，同时体外经皮渗透实验验证了超临界CO2萃取技术应用于经皮给药制剂脂溶性有效成分提取的可行性与合理性，为进一步研究指标成分透皮行为奠定基础。

有研究证实，白芥子中芥子酶活性[6]，以及甘遂中大戟二萜醇浓度[7-8]是引起皮肤刺激性的关键影响因素，有效控制系统中这两种成分浓度水平以及释放速率，可有效避免目前白芥子涂方皮肤刺激性大和质量不可控的弊端。