七氟烷和地氟烷对发育中大脑神经元可塑性的影响

石宝序，邵安胜

(山东省日照市岚山区人民医院1.神经内科；2.急诊内科，日照 276800)

神经元可塑性是指在神经元再生、损伤或死亡过程中，神经元到神经环路所发生的适应性变化，这种变化可发生在大脑发育和成熟阶段，并存在于中枢和外周神经系统[1]。中枢神经系统具有高度可塑性，并且受到内在因素和外界因素的影响[2]。神经元可塑性的变化主要表现为大脑学习记忆功能、神经元突触、神经细胞结构和功能的变化等[3]。在发育中大脑中，大脑神经元可塑性具有重要作用[4]。突触素是神经可塑性的分子标志之一，可作为神经元可塑性受损伤程度的指标[5]。当大鼠神经元可塑性受到损伤后，大鼠脑内突触体内突触素免疫活性下降[5]。大量研究证明，吸入性麻醉气体对人体具有神经毒性[6]。七氟烷和地氟烷是两种吸入性麻醉气体，临床常用于婴幼儿麻醉[7]。婴幼儿时期是大脑发育关键时期，对内外环境变化十分敏感[8]。然而，目前对于七氟烷和地氟烷毒性作用的研究主要集中在老年大鼠，对于发育中大鼠的研究笔者较少见到。近期研究发现，急性暴露于吸入性麻醉剂会导致发育中大脑的病理性损伤，严重者可导致学习和记忆功能障碍[9]。笔者在本研究中对1个月龄SD大鼠分别给予3%七氟烷和地氟烷麻醉，其浓度接近于临床婴幼儿七氟烷和地氟烷麻醉剂量，以探讨七氟烷和地氟烷对发育中大脑神经元可塑性的影响，并研究其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 1个月龄清洁级健康雄性SD大鼠，体质量100～105 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验动物生产许可证号：SYXK(京)2017-0022。饲养室温度(23±2)℃，相对湿度45%～50%，每天光照时间12 h，自由进食、进水，适应性饲养1周。

1.2主要试剂 七氟烷(Sev，山东鲁南贝特制药有限公司，批号：65120501，设定出气口七氟烷浓度3.2%)和地氟烷(Des，百特公司，批号：3957，设定出气口地氟烷浓度7.5%)；内源性大麻素2-AG注射液购自江苏瑞恒医药股份有限公司(批号：20112548，分析纯)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒及增强化学发光(enhanced chemilumin escence,ECL)发光试剂盒购自碧云天生物技术研究所(批号：20140303)；具脱氧尿苷单克隆(BrdU)抗体、人生长相关蛋白-43(grouth-associated protein-43,GAP-43)抗体、磷酯化神经突触素(phosphorvlated neuro syna ptophysin,SYN)抗体、微管相关蛋白2(microtubule associated protein,MAP-2)抗体和β-actin抗体均购自Abcom公司；其余为国产分析纯试剂。

1.3大鼠的分组及给药 选取1个月龄清洁级健康雄性SD大鼠60只，采用随机数字法分为正常对照组、七氟烷组和地氟烷组，每组20只。大鼠禁食禁水12 h。以100%氧气作为载气，流量设置为2 L·min-1，麻醉箱内温度设定为37～38 ℃。当麻醉箱内七氟烷和地氟烷分别达到5%时，将大鼠放入麻醉箱内，开始计时并保持吸入4 h。各箱气体浓度采用麻醉气体监测仪监测。

1.4行为学观察 采用电刺激逃避即跳台法观察大鼠行为学特征。大鼠学习记忆功能的观察指标为实验过程中各大鼠出现的错误反应次数和潜伏期。

实验装置：跳台装置为 120 cm×80 cm×24 cm 有机玻璃箱，刺激电极为箱底铜栅。将箱子平均分为5格，大鼠回避电击的安全台为每格内分别放置高 8.5 cm，直径 10.5 cm 橡胶垫。

实验过程：将大鼠放入试验箱内适应5 min，以36 V交流电电击大鼠。大鼠在遭电击后逃上橡胶垫，再从橡胶垫上跳下，以双足接触铜栅遭到电击为错误反应次数1次。先对大鼠进行3 min训练，并记录错误反应次数。24 h后再进行测验。实验方法同上，以大鼠首次从橡胶垫跳下时开始计时，作为大鼠触电潜伏期，并以大鼠第1次和第2次测试过程中出现的错误次数作为学习记忆功能的观察指标。

1.5BrdU标记反应 实验中大鼠腹腔注射BrdU溶液，50 mg·kg-1，共6 d，第7 天处死。迅速取出大鼠海马组织，每组随机选取6只大鼠对海马组织进行染色。经磷酸盐缓冲液(phosplate buffer saline,PBS)洗涤，4%多聚甲醛固定，山羊血清封闭，BrdU一抗工作液室温孵育3 h。孵育结束后，采用二抗工作液室温孵育15 min。显色后，经苏木精复染，脱水，透明，封片。荧光显微镜下观察并分析。Image Pro Plus 6.0对图像进行半定量分析，并计算阳性细胞的积分吸光度值(A值)，其中阳性细胞表达的强度和数量与A值成正比。

1.6大鼠海马组织相关蛋白的检测 实验结束后处死大鼠，迅速分离海马组织，-80 ℃保存备用。提取脑组织蛋白，采用Western bloting检测海马组织GAP-43、SYN和MAP-2蛋白表达水平。

将大鼠海马组织置于研钵，加入一定体积蛋白裂解液，充分研磨，于冰上裂解30 min，4 ℃下12 000×g离心10 min，吸取上清液，并使用BCA蛋白浓度试剂盒对其进行蛋白定量。选取5%浓缩胶和10%分离胶，取20 μL蛋白样品进行上样，电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上。10%脱脂乳粉溶液封闭2 h，一抗(1：1000)4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次15 min，二抗(1：4000)室温孵育2 h，TBST洗膜3次。化学发光法对蛋白显色。

2 结果

2.1对发育中大鼠逃避行为潜伏期的影响 正常对照组、七氟烷组、地氟烷组潜伏期分别为(53.32±6.34)，(35.34±3.37)，(36.94±4.14) s。行为学检测数据表明，与正常对照组比较，七氟烷组和地氟烷组第一次跳下平台潜伏期均显著缩短(P<0.01)，提示七氟烷和地氟烷对发育中大鼠的逃避行为潜伏期有消极影响。

2.2对发育中大鼠学习记忆错误次数的影响 正常对照组、七氟烷组、地氟烷组平均错误反应次数分别为(1.94±1.04)，(4.47±1.59)，(3.93±1.43)。与正常对照组比较，七氟烷组和地氟烷组错误次数均显著增加(P<0.01)，提示七氟烷和地氟烷均可以在一定程度上损伤大鼠发育中大脑的学习记忆能力。

2.3对发育中大鼠神经干细胞增殖和分化的影响 正常对照组、七氟烷组、地氟烷组BrdU分别为(3.45±0.54)×105，(2.17±0.39)×105，(2.03±0.28)×105。BrdU标记反应结果显示，与正常对照比较，七氟烷组和地氟烷组大鼠脑内损伤区周围BrdU标记反应显著减弱(P<0.01)，提示七氟烷和地氟烷与抑制发育中大脑内源性神经干细胞的增殖与分化有关。

2.4对发育中大鼠海马组织GAP-43蛋白表达的影响 见图1。正常对照组、七氟烷组、地氟烷组GAP-43蛋白表达分别为(0.95±0.14)，(0.27±0.09)，(0.14±0.02)。Western Blot结果显示，与正常对照组比较，七氟烷组和地氟烷组大鼠发育中脑内海马组织中GAP-43蛋白表达量均显著降低(P<0.01)，说明七氟烷和地氟烷均能够下调大脑发育过程中神经元突起生长相关蛋白GAP-43的表达，从而抑制发育大脑神经元的可塑性。

2.5对发育中大鼠海马组织中SYN蛋白表达的影响 见图1。正常对照组、七氟烷组、地氟烷组SYN蛋白表达量分别为(0.91±0.14)，(0.37±0.09)，(0.23±0.08)。Western bloting结果显示，与正常对照组比较，七氟烷组和地氟烷组大鼠发育中脑内海马组织中SYN蛋白表达量均显著降低(P<0.01)，说明七氟烷和地氟烷均能够下调大脑发育过程中神经元突起生长相关蛋白SYN的表达，从而抑制发育大脑神经元的可塑性。

图1 3组大鼠海马组织GAP-43蛋白表达情况

图2 3组大鼠海马组织SYN蛋白表达情况

2.6对发育中大鼠海马组织中MAP-2蛋白表达的影响 见图2。正常对照组、七氟烷组、地氟烷组MAP-2的蛋白表达量分别为(0.86±0.11)，(0.34±0.08)，(0.27±0.06)。Western bloting结果显示，与正常对照组比较，七氟烷组和地氟烷组大鼠发育中脑内海马组织中MAP-2蛋白表达量均显著降低(P<0.01)，提示七氟烷和地氟烷均能下调大脑发育过程中神经元突起生长相关蛋白MAP-2的表达，从而抑制发育大脑神经元的可塑性。

图3 3组大鼠海马组织MAP-2蛋白表达情况

3 讨论

婴幼儿时期是大脑的发育时期，此时神经可塑性强，也是各种脑损伤治疗的最佳时期，但也极易受到内外因素影响[10]。婴幼儿手术中，吸入性麻醉药广泛应用于临床[11]。吸入性麻醉药主要作用为降低脑血管阻力、扩张血管、增加脑血流等，其中七氟烷和地氟烷均具有较强的血管扩张作用[12]。七氟烷作为常见吸入性麻醉药，可快速使患者失去知觉，并在术后可快速恢复，因此广泛应用于临床手术[13]。地氟烷主要作用是使交感神经兴奋、心率增快、血压升高，从而使脑部血流加速[14]。当使用地氟烷麻醉时，如在短时间内提高地氟烷吸入剂量，可对大脑和心血管产生损伤。婴幼儿时期是大脑发育高峰期，因此对吸入性麻醉药较敏感[15]。吸入性麻醉药具有一定程度神经毒性，尤其是对发育中大脑学习记忆功能的损伤较显著。本研究结果显示，七氟烷和地氟烷均可以显著增加大鼠错误次数，并显著缩短第一次跳下平台潜伏期，说明七氟烷和地氟烷均可在一定程度上损伤大鼠发育中大脑的学习记忆能力。

在哺乳动物神经系统，神经干细胞具有自我更新和向多种神经细胞分化的潜力。脑部受损后，神经干细胞发生增殖、分化及迁移现象，从而修复受损区域的神经细胞[16]。BrdU作为一种DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物，可通过标记细胞反映神经干细胞的增殖强度。本研究结果发现，七氟烷组和地氟烷组大鼠脑内损伤区周围BrdU的标记反应显著减弱，推测七氟烷和地氟烷与抑制发育中大脑内源性神经干细胞的增殖与分化有关，从而阻碍大脑受损部位的神经修复过程。

在中枢神经系统，神经元可塑性是大脑学习记忆功能的基础。研究发现，多种蛋白参与调控神经元的可塑性，如突触形成的SYN、GAP-43和MAP-2[17]。研究发现，大脑海马组织是与学习记忆功能密切相关的区域，是神经元可塑性常发生的部位。GAP-43作为神经组织中与生长相关的专一性蛋白，参与神经系统的发育及再生，是神经重塑的分子标志之一。在神经系统正常发育下，GAP-43蛋白表达量较高，而当神经系统受损后，GAP-43蛋白表达量显著降低[18]。SYN是突触中的特异性标志膜蛋白，可调节突触可塑性，并作为评价神经元重塑性的标志物[19]。在神经系统发育过程中，SYN表达量可间接反映突触大小和数量变化。MAP-2是微管相关蛋白家族成员之一，是神经细胞的骨架成分，与突触可塑性及神经元的生长再生具有密切的关系，可作为神经系统可塑性的分子标志物之一[20]。研究发现，当脑神经受损后，大脑组织MAP-2表达显著减少。本研究表明，七氟烷和地氟烷均能够下调大脑发育过程中神经重塑相关蛋白GAP-43、SYN和MAP-2的蛋白表达，从而抑制发育大脑神经元的可塑性。

综上所述，七氟烷和地氟烷均对发育中大脑的学习记忆能力具有一定的损伤作用，并可通过抑制内源性神经干细胞的增殖分化，下调大脑发育过程中神经元突起生长相关蛋白GAP-43、SYN和MAP-2的表达，从而抑制发育大脑神经元的可塑性。