ZNF436在胃癌中的表达及调控WNT/β-catenin对胃癌细胞迁移及侵袭的影响

秦 文 赵楠楠 韩永焕 徐亚君

胃癌(Gastric cancer，GC)是世界范围最常见的恶性肿瘤[1]。在我国，GC在恶性肿瘤中的发病率高居第二位，是癌症死亡的第二主要原因[2-3]。近年来尽管饮食习惯的改善和医疗保健的提升，胃癌发病率有所下降，但晚期GC的预后仍很差。因此，迫切需要寻找早期诊断和治疗GC的靶点。最新研究显示，锌指蛋白(ZFPs)家族作为癌基因或抑癌基因，广泛参与恶性肿瘤的发生发展[4-6]；ZNF436是最近发现的肿瘤相关基因，在多种实体瘤中发挥着重要的作用，但在胃癌中的作用机制尚不清楚[7-8]。本研究通过验证ZNF436基因在人胃癌组织和细胞系中表达，分析对胃癌生存期影响，及ZNF436对人胃癌细胞迁移和侵袭作用，以期揭示其对胃癌发生发展的影响机制。

1 材料与方法

1.1 病例资料

选取2015年1月—2018年1月赤峰学院附属医院治疗的45例胃癌患者，24例正常胃组织的临床资料；胃癌患者年龄39～74岁，中位年龄55.4岁；其中男性29例，女性16例；两组年龄和性别无统计学差异。胃癌组织选取包括手术中取得的癌组织和癌旁组织，正常胃组织来源于体检筛查患者组织；所有组织均在液氮中快速冷冻，然后贮存于-80℃。所有肿瘤患者均为原发性胃癌，在手术切除前均未接受化疗、放疗或其他治疗，无其他合并肿瘤；排除标准：临床资料不全者、合并严重糖尿病心脏病的疾病、转移性肿瘤、既往胃肠道手术治疗史。该研究由赤峰学院附属医院医学伦理委员会批准，所有患者均签字同意。根据美国联合发布的TNM分期指南(2016)癌症委员会，病理诊断由本院两位病理学家出具。ZNF436表达与预后通过在线生存数据分析(http：//kmplot.com/analysis/)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 本研究中胃癌细胞系及其永生化人胃粘膜上皮细胞系在添加10%血清的RPMI-1640培养基中培养；培养液中加入1%青霉素/链霉素；在37℃，5%CO2的细胞孵育箱中培养；当培养液微黄或变黄时重新消化离心并更换细胞培养液。

1.2.2 ZNF436敲减载体构建和细胞转染 ZNF436-siRNA设定为本研究的实验组、NC-siRNA设定为本研究的对照组；收集活性状态下的胃癌MKN028细胞，消化、离心后种于六孔板中；在细胞孵育箱中继续培养，当细胞密度至70%～80%时进行细胞转染，以Lipofectamine-3000为转染试剂，转染Si-Flag-ZNF436质粒(实验组)和空质粒Si-Flag-NC(对照组)，每孔5 μg质粒，细胞在孵育箱中培养48 h后，收集细胞进行相应的功能实验。

1.2.3 RNA提取和qRT-PCR 从细胞系和新鲜标本中提取总RNA。参考说明书要求，使用TransZol RNA试剂盒提取。逆转录合成cDNA后，通过qRT-PCR验证基因的相对表达。反应条件为：95℃变性10 min，95℃持续15 s，60℃持续20 s，72℃持续20 s，最后72℃延伸30 s；共40个总循环；以β-actin为内参引物。实时荧光的相对表达分析PCR扩增程度，以扩增指数期为起始模板进行半定量分析；扩增指数越高，mRNA的相对表达越高。所有实验独立重复三次。

1.2.4 细胞划痕实验 收集上述实验组和对照组胃癌细胞株MKN028；消化，离心，计数，取1×105细胞均匀种植于无菌六孔板中；细胞孵育箱中继续培养，约20 h细胞融合度约90%时，以无菌小枪头在六孔板底部轻微垂直划线，以无血清1640液继续培养，间隔12 h倒置显微镜下拍照，测量不同时间段的划痕宽度以评估细胞迁移能力。

1.2.5 Transwell细胞侵袭实验 在Transwell小室上室中加入基质胶(无血清1640∶基质胶=1∶5)混匀，基质胶小室放入细胞孵育箱中约2～4 h，待基质胶凝固。收集实验组和对照组细胞，消化，离心，计数，取3×103细胞/空种于小室上室；下室加入15% 1640培养基后放入细胞孵育箱中继续培养，继续培养24 h后取出小室，固定，染色，计数；计数并评价细胞迁移能力。

1.2.6 免疫蛋白印迹实验 从组织或细胞中提取蛋白质并使用BCA蛋白质分析试剂盒定量蛋白浓度；处理后蛋白样品上样，每孔约50 μg；通过十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺胶电泳分离，转膜至PVDF膜上。使用5%脱脂奶粉室温下封闭2 h；分别加入一抗孵育4℃过夜；室温下加入二抗封闭孵育1～2 h；显色剂显色，对蛋白条带进行吸光度扫描。目的和对照基因蛋白相对表达以吸光度值/内参照吸光度值的比值表示；所有实验独立重复三次。

1.2.7 裸鼠成瘤实验检测ZNF436基因敲除对肿瘤细胞增殖的影响 裸鼠转移瘤的方法和步骤同文献所述[6]。收集稳定敲降ZNF436的MKN028细胞和对照细胞(3×106/孔)，离心后使用2 mL PBS重悬，将PBS的肿瘤细胞液5 s内注入裸鼠尾静脉(n=5)；继续饲养小鼠约8周后处死，予以取出肝脏中转移瘤，并进行相应的功能实验。

1.2.8 免疫组织化疗法 组织切片脱蜡、脱缸、抗原修复(微波热修复法)、H2O2室温下封闭、孵一抗和二抗、DAB显色、染核、封片镜检等。在倒置显微镜下随机五个视野，计算相对光密度。选用已知阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。根据病理评分标准[11]：两位病理医师采用双盲法阅片，按染色深浅进行评分，无阳性染色为0分，浅黄色为1分，深黄色为2分，棕黄色为3分；阳性细胞非百分比评分，≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。最后二者相乘，0～4分为低表达，4～12分为高表达。

1.3 统计学分析

运用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，各实验均独立重复3次，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验。癌与癌旁组织配对分析采用配对t检验，生存分析采用在线Kaplan-Meier生存曲线分析ZNF436的表达与预后关系，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ZNF436 mRNA在胃癌组织和细胞系中表达

与癌旁组织相比，ZNF436 mRNA表达在胃癌组织中表达上调(P<0.001)(图1A)；与正常胃组织相比，ZNF436 mRNA表达在胃癌组织中表达上调(图1B)(P<0.001)。同时对ZNF436 mRNA在胃癌细胞系中相对表达的研究发现，与永分化胃上皮细胞GES-1相比，ZNF436 mRNA在胃癌细胞系MKN028、AGS、SGC-7901、BGC-823和MGC-803中表达上调(图1C)(P<0.001)。在线生存数据分析发现，ZNF436的表达程度与胃癌预后有关，ZNF436基因高表达患者预后比低表达患者差(P=0.0038)(图1D)；提示ZNF436可能作为潜在癌基因参与胃癌的进展。

图1 ZNF436在胃癌组织和细胞系中表达Figure 1 Expression of ZNF436 in gastric cancer cell lines and gastric cancer tissuesNote：A.The expression of ZNF436 mRNA was up-regulated in gastric cancer tissues，P<0.001；B.The expression of ZNF436 mRNA was up-regulated in gastric cancer tissues，P<0.001；C.The expression of ZNF436 mRNA was up-regulated in gastric cancer cells when compared to GES-1 cells，*** P<0.001；D.Prognostic analyses showed that the high level of ZNF436 could herald a worse survival rate.

2.2 ZNF436蛋白在胃癌组织中表达

与配对癌旁组织相比，ZNF436蛋白在胃癌组织中高表达(t=12.45，P<0.001)。通过IPP8.0软件分析ZNF436蛋白表达光密度显示，与配对癌旁正常组织相比，ZNF436在胃癌中光密度升高(t=16.23，P<0.001)(图2)。因此，研究显示ZNF436可能作为癌基因参与胃癌的进程。

2.3 ZNF436基因敲降抑制细胞迁移和侵袭

为进一步验证ZNF436基因能否作为功能性癌基因参与胃癌的进程。本研究选取了ZNF436表达最高的胃癌细胞系MKN028为研究对象。进一步对胃癌细胞系MKN028中ZNF436基因进行敲降；细胞划痕实验显示，稳定敲降ZNF436的实验组MKN028细胞划痕愈合能力显著低于对照组(P<0.001)(图3A)。Transwell实验对细胞侵袭能力做了定量分析，结果发现稳定敲降ZNF436的实验组穿过小室的细胞数显著低于对照组(P<0.001)(图3B)。

图2 免疫组织化学法检测ZNF436蛋白在人胃癌组织中的表达Figure 2 Expression of ZNF436 protein in human gastric cancer tissuesNote：A.Immunohistochemistry；B.Expression of ZNF436 protein was up-regulated in gastric cancer tissues when compared with adjacent tissues，P<0.001.

图3 ZNF436对细胞迁移和侵袭的影响Figure 3 Effects of ZNF436 on migration and invasion of ZNF436 cellsNote：A.Migration of empty vector- or si-ZNF436 tumor cells in scratch wound healing assays，P<0.001(200×)；B.The invasion capacity of vector- or si-ZNF436 cells was decreased，*** P<0.001(200 ×).

2.4 ZNF436基因敲降在体内抑制肿瘤细胞增殖

前期体外实验中敲降ZNF436基因后能抑制肿瘤细胞的转移，为进一步探讨敲降ZNF436基因是否可以抑制裸鼠体内转移瘤的生长；本研究将实验组细胞和对照组细胞注入裸鼠尾静脉，在注射后8周从取出裸鼠肝脏；结果显示，实验组小鼠的肿瘤大小和平均体积显著降低(P<0.001)(图4A)。HE染色研究肿瘤的表达(图4B)，免疫蛋白印迹实验分析ZNF436和Ki-67的表达；与对照组相比，细胞增殖相关蛋白Ki-67的表达显著减少(P<0.001)(图4C，4D)。

2.5 ZNF436基因敲降抑制胃癌细胞迁移和侵袭的机制

分别取实验组和对照组中细胞，提取mRNA总蛋白，采用蛋白质印迹法检测WNT/β-catenin以及下游靶基因、上皮-间质转化相关分子的表达水平。结果显示，ZNF436基因敲降后active-β-catenin、C-myc、Vimentin、N-cadherin、MMP7的蛋白和mRNA表达下调(P<0.001)；E-cadherin的蛋白表达水平上调(P<0.001)(图5A，5B)。

图4 Si-ZNF436在体内实验中抑制转移瘤的形成Figure 4 siRNA ZNF436 inhibited tumor transformation in vivoNote：A.tumors derived from nude mice；B.HE staining；C.Relative expression of ZNF436 and Ki67 in nude mice tumor tissues；D.Quantitative analysis of protein，***P<0.001，when compared with the vector.

图5 蛋白质印迹法检测ZNF436敲降后对WNT/β-catenin信号通路的影响Figure 5 Ectopic expression of ZNF436 disrupted the WNT/β-catenin signalingNote：A.Western blot was performed using antibodies against total β-catenin，active β-catenin and its downstream targets；B.Quantitative analysis of protein，*** P<0.001，when compared with the vector.

3 讨论

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，是临床最常见的消化道恶性肿瘤，在我国各种恶性肿瘤中发病率位居前列；胃癌的发病呈年轻化的倾向[9]。由于地域经济、医疗水平的差异；大多数胃癌患者缺乏有效的早期筛查手段；部分确诊患者发现时即为局部晚期或合并远处转移；而转移是胃癌治疗失败的主要原因之一。转移仍然是肿瘤治疗最大的临床挑战，也是导致癌症死亡和肿瘤综合治疗失败的重要原因。因此，如何预防与治疗转移是提高和改善临床预后的重要基础。随着基因组学的深入研究，越来越多的学者开始致力于肿瘤转移过程中的相关靶点的研究，以期寻找肿瘤转移过程中的分子靶点。EMT是一种保守的细胞过程，其特点是上皮细胞极性丧失，间质细胞发育特征明显，可侵袭和迁移至全身，被认为是肿瘤转移的重要机制[10]。在胃癌的各种研究中已经证实了EMT相关的转移。EMT可以通过检测上皮标记物，如E-钙粘蛋白和间充质标记物，如波形蛋白和N-钙粘蛋白。鉴于肿瘤转移属性，癌症发病的EMT过程已被认为是癌变的关键标志，因此，寻找和证实EMT过程中的相关靶点具有重要临床意义。

锌指蛋白(ZFPs)是脊椎动物基因组家族中最大的转录因子；大约1/3的ZFP包含与Krüppel相关KRAB结构，超过一半ZFPS聚集在染色体19q13区域[6-8]。ZFPs在调节细胞增殖、凋亡、分化和肿瘤发生中起重要作用。部分ZFPs基因如ZBRK1、ZNF382和ZNF569被报道作为抑癌基因参与肿瘤进展[11]；启动子甲基化对肿瘤抑癌基因的异常失活常常与肿瘤的发生有关。而ZFPs在胃癌中作用的报道非常少见。ZNF436的cDNA为3.8 kb，编码470个氨基酸[6-8]；这种蛋白质在从大鼠到人的不同脊椎动物物种的进化过程中高度保守；已有文献报道在组织器官发育，肿瘤形成中具有重要的作用，但在胃癌中的作用尚不清楚。

本研究中ZNF436在胃癌细胞系和组织中均表达上调。在线数据分析发现，大样本临床预后数据研究中，ZNF436的高表达提示预后不良，提示ZNF436可能作为功能性癌基因参与胃癌的进程中[6-8]。通过基因敲降使ZNF436高表达的胃癌细胞系MKN028中ZNF436表达下调；细胞划痕实验显示，敲降ZNF436基因后实验组划痕愈合能力显著低于对照组，差异具有统计学意义。侵袭实验显示，敲降ZNF436基因后的实验组细胞，细胞侵袭能力明显下调。文献研究显示，ZFPs通过WNT/β-catenin信号通路参与肿瘤的发生发展。ZNF436是否也通过WNT/β-catenin信号通路调控胃癌的转移尚不清楚。进一步验证ZNF436调控胃癌细胞系MKN028迁移和侵袭的分子机制发现，敲降ZNF436后的实验组细胞中，active β-catenin、c-myc、Vimentin、N-cadherin和MMP7的蛋白表达水平降低，E-cadherin的蛋白表达水平上调；与文中报道相一致[12]。而β-catenin蛋白的异常活化是导致肿瘤发生的重要原因[16]；上皮-间充质转化(EMT)使肿瘤细胞获得了迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型，与肿瘤迁移和侵袭密切相关，往往提示着预后不良[13]；MMPs的活化是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程[19]。

综述所述，ZNF436在胃癌中表达上调，可能作为潜在的癌基因参与胃癌的转移中；但ZNF436基因能否作为胃癌诊断、治疗和判断预后的分子靶点，尚需要进一步临床验证。