CCDC8和TGF-β1在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

孙立春 李丹丹 李 净 于凤玲

肺癌对人群健康和生命具有重大的威胁。尽管有手术、化疗、放疗、靶向等治疗手段，但肺癌患者的生存时间仍较短[1-2]。需要寻找新的与诊断治疗预后相关的靶点，为最终攻克肺癌奠定基础。

卷曲螺旋结构蛋白8(Coiled-coil domain containing 8，CCDC8)基因参与细胞凋亡和生长调控，与3M综合征(3M Syndrome)密切相关[3]。CCDC8与非小细胞肺癌的关系尚不明确。本研究在TCGA数据库的非小细胞肺癌数据中分析发现CCDC8表达与TGF-β1表达相关，因此我们推测CCDC8可能与TGF-β1途径相互作用，在非小细胞肺癌发生发展中发挥作用。我们在TCGA非小细胞肺癌数据库分析了CCDC8和TGF-β1表达与患者生存的关系。并在我院204例非小细胞肺癌病理组织中分析了CCDC8和TGF-β1的表达及其与临床病理参数及患者生存的关系，为进一步研究CCDC8和TGF-β1在非小细胞肺癌中的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

采用TCGA公开的NSCLC数据库数据分析CCDC8、TGF-β1 RNAseq与患者生存关系。病理标本取自我院2013年1月—2014年1月经过治疗的手术病理证实的非小细胞肺癌组织。全组病人中腺癌122例，鳞癌82例；男性136例，女性68例，平均年龄57.56±9.03岁(31～76岁)。组织学分级：高分化12例，中分化96例，低分化96例。TNM分期：Ⅰ期91例，Ⅱ期42例，Ⅲ期71例。所有组织取下快速处理后于-80℃冰箱中保存，随访工作通过与病人或家属的沟通进行。本研究经哈尔滨医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准后进行。

1.2 免疫组织化学方法

抗体CCDC8、TGF-β1的稀释度分别为1∶50，1∶80，置于4℃冰箱过夜，DAB显色。用已知NSCLC阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。以癌细胞膜、细胞质、细胞核染色呈棕黄色颗粒为阳性。由两位病理医生单独判定结果。结果判定：根据阳性细胞染色的百分率分级：0：0%～5%；1：6%～25%；2：26%～50%；3：51%～75%；4：>75%。根据染色强度分级：1：淡黄色染色没有明显颗粒；2：黄色染色有明显颗粒；3：棕黄色染色明显颗粒。两个评分相乘得到最后评分：0～4为阴性；6～12为CCDC8、TGF-β1阳性。

1.3 统计学方法

应用R软件对TCGA数据库数据分析，应用SPSS 19.0统计软件对免疫组化数据进行统计分析，CCDC8、TGF-β1与临床病理参数的关系采用χ2检验和Fisher精确检验，相关性分析应用Pearson相关性分析；生存分析采用Kaplan-Meier方法和Log-rank检验，采用COX回归分析各因素对肺鳞癌患者生存预后的影响，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CCDC8、TGF-β1的表达

TCGA数据库中CCDC8和TGF-β1在正常肺组织中较肿瘤组织中高表达(P<0.05)(图1)。在TCGA数据库中的1014例NSCLC数据中，CCDC8的表达与TGF-β1表达呈正相关。在513腺癌数据和501鳞癌数据中，CCDC8的表达与TGF-β1表达也呈正相关(图2)。免疫组化检测CCDC8、TGF-β1蛋白定位于非小细胞肺癌的细胞浆内，呈黄色、棕黄色颗粒。CCDC8、TGF-β1在本组病理组织中阳性表达率分别是41.6%，54.4%(图3)。

图2 TCGA数据库中非小细胞肺癌中CCDC8与TGF-β1表达相关Figure 2 The relationship between the expression of CCDC8 and TGF-β1 in NSCLC from the TCGA databaseNote：A.NSCLC；B.Adenocarcinoma；C.Squamous carcinoma.

图1 TCGA数据库中CCDC8和TGF-β1在正常肺组织及NSCLC中表达差异Figure 1 The differentiative expression of CCDC8 and TGF-β 1 in normal lung tissues and NSCLC tissues

图3 免疫组化染色检测CCDC8和TGF-β1在NSCLC中表达Figure 3 Expression of CCDC8 and TGF-β1 in NSCLC by immunohistochemical stainingNote：A.The expression of CCDC8 in adenocarcinoma tissues；B.The expression of TGF-β1 in adenocarcinoma tissues；C.The expression of CCDC8 in squamous carcinoma tissues；D.The expression of TGF-β1 in squamous carcinoma tissues.

2.2 CCDC8和TGF-β1表达与非小细胞肺癌临床病理特征的关系

在204例病理组织中，CCDC8的表达与NSCLC组织中TGF-β1的表达有关(P<0.05)，而与性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、分化程度无关(P>0.05)；TGF-β1表达与性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、分化程度无关(P>0.05)。在鳞癌组织中CCDC8的表达与TGF-β1表达有关(P<0.05)。在腺癌组织中CCDC8与TGF-β1表达无关(P>0.05)(表1)。

2.3 CCDC8、TGF-β1及其他临床病理特征与非小细胞肺癌患者预后关系

TCGA数据库1 014例NSCLC数据中，Kaplan-Meier方法分析CCDC8、TGF-β1表达与患者预后无关。分层分析：在腺癌数据中，CCDC8、TGF-β1表达与患者OS无关。在鳞癌数据中，CCDC8表达与患者OS相关；TGF-β1表达与患者OS无关(图4)。204例病理组织中CCDC8和TGF-β1表达与患者预后无关(χ2=2.271，P=0.132；χ2=2.116，P=0.146)。分层分析，腺癌病理组织中CCDC8和TGF-β1表达与患者OS无关(χ2=0.002，P=0.967；χ2=0.054，P=0.816)；鳞癌组织中CCDC8表达与患者OS相关(图4)。单因素Cox分析结果显示，CCDC8及TNM分期与肺鳞癌患者的OS有关。将CCDC8、TGF-β1表达及TNM分期纳入多因素Cox回归分析。结果显示CCDC8表达和TNM分期为肺鳞癌OS的影响因素(表2)。

表1 CCDC8、TGF-β1在NSCLC中的表达及与临床病理特征的关系Table 1 The correlation between the expression of CCDC8 and TGF-β1 with clinicopathological features of NSCLC

表2 CCDC8、TGF-β1表达及临床病理特征与肺鳞癌患者总生存关系的Cox分析结果Table 2 Relationship between the expression of CCDC8 and TGF-β1，and clinicopathological features with OS in NLSC

图4 CCDC8和TGF-β1(高对比低)表达的NSCLC患者KM生存曲线 Figure 4 KM survival curves of CCDC8 and TGF-β1 expression in patients with NSCLC(High vs.Low).Note：A.The expression of CCDC8 in NSCLC(TCGA)；B.The expression of TGF-β1 in NSCLC(TCGA)；C.The expression of CCDC8 in NSCLC；D.The expression of TGF-β1 in NSCLC；E.The expression of CCDC8 in adenocarcinoma(TCGA)；F.The expression of TGF-β1 in adenocarcinoma(TCGA)；G.The expression of CCDC8 in adenocarcinoma；H.The expression of TGF-β1 in adenocarcinoma；I.The expression of CCDC8 in squamous carcinoma(TCGA)；J.The expression of TGF-β1 in squamous carcinoma(TCGA)；K.The expression of CCDC8 in squamous carcinoma；L.The expression of TGF-β1 in squamous carcinoma.

3 讨论

人类CCDC8基因位于19q13.32，编码卷曲螺旋结构蛋白8。CCDC8蛋白是一种膜蛋白，目前功能不明，在所有组织中均有表达。通过亲和纯化蛋白和质谱分析发现与CCDC8基因密切相关的基因有CUL7(Cullin7)、OBSL1(Obscurin-Like1)、P53、DBC1(Deleted in breast cancer 1)、ANKRA2(Ankyrin-repeat protein 2)、YB-1、14-3-3、INF462、ROC1、FBXW8、RCN3、LMNB2、BCR-ABL、RFX7等14个[3]。当DNA受到损伤时，CCDC8蛋白促进Tip60介导的P53乙酰化参与P53介导的细胞凋亡。CCDC8蛋白可能通过与细胞支架衔接蛋白的相互作用参与生长调控。突变CCDC8基因通过与泛素连接酶CUL7、细胞骨架蛋白OBSL1和P53基因相互作用，导致人体生长发育受抑制身材矮小的3M综合征(3M-syndrome)[4]。CCDC8与艾滋病毒(HIV-1)结构蛋白Gag相互作用，诱导Gag的内化、多泛素化和降解从而发挥抗HIV作用[5]。

在癌症基因表达谱数据库研究中，P90/CCDC8在肿瘤组织中表达不一致。在肾癌、皮肤癌、胃癌中低表达，在其它肿瘤中高表达。65%～80%的神经胶质瘤患者19号染色体长臂缺失，CCDC8、FBXW8、RCN3基因正是位于该区段内[6]。Y盒结合蛋白基因(Y-boxbindingprotein-1，YB-1)与肿瘤细胞的转录和翻译有关，它与CCDC8基因相互作用可抑制体外培养的乳腺癌和前列腺癌细胞的增殖[7]。用FLT3-ITD在CCDC8基因敲除的动物模型中诱导了急性粒细胞白血病，而在未敲除CCDC8基因的动物中未能诱导急性粒细胞白血病。CCDC8基因可能是FLT3-ITD诱导急性粒细胞白血病的重要因素[8]。在乳腺癌脑转移灶中，BNC1、GALNT9、CCDC8甲基化程度高，而在原发灶中甲基化程度很低[9]。这些研究发现提示CCDC8对肿瘤的发生发展有重要作用。

CCDC8在非小细胞肺癌中的作用尚不明确。本研究用TCGA数据库的非小细胞肺癌数据分析发现CCDC8 mRNA1表达与TGF-β1 mRNA表达呈正相关。分别用腺癌和鳞癌数据分析CCDC8表达与TGF-β1表达均呈正相关。本研究进一步在我院胸外科204例非小细胞肺癌中利用免疫组化检测了CCDC8和TGF-β1蛋白的表达，并分析了它们与临床病理参数及预后的关系。结果表明，在非小细胞肺癌中CCDC8和TGF-β1蛋白表达呈正相关。在这组患者中，未发现CCDC8和TGF-β1蛋白表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移、病理分化有关。我们的研究提示，在非小细胞肺癌中CCDC8可能与TGF-β1通路相互作用。近年来的研究显示TGF-β1在肿瘤早期是一种肿瘤抑制因子，能够有效地抑制造血干细胞、内皮细胞、淋巴细胞等增殖。TGF-β1、PTEN、p53家族成员和纤连蛋白等这些因子相互作用有利于维持正常的细胞表型并消除恶性转化细胞的出现。TGF-β1信号与CD103整合素信号结合，加强CD103与E-钙粘蛋白的相互作用促进T细胞粘附和细胞骨架重排，进而促进肺肿瘤微环境中的T淋巴细胞积累和抗肿瘤活性[10-11]。但是在肿瘤的进展期，TGF-β1又作为一种肿瘤促进因子，刺激组织纤维化和细胞外基质沉积，扰乱免疫功能，刺激血管生成和促进上皮间质转化[12]。TGF-β1对非小细胞肺癌不同的预后作用可能与TGF-β1既能抑癌又能促癌有关[10，13]。李云芬等[14-15]发现CCDC8在乳腺组织，良性乳腺肿瘤中的表达明显高于乳腺癌组织；并发现在乳腺癌组织中CCDC8的表达与nm23显著负相关。在原发性肾癌中CCDC8启动子区域甲基化率为35%，而正常肾组织中没有CCDC8甲基化[16]。中国医科大学的一项研究在147例非小细胞肺癌组织中检测CCDC8表达，发现CCDC8在癌旁组织中表达显著高于癌组织；并与癌细胞分化和淋巴结转移有关，是预后好的指标。下调CCDC8后A549腺癌细胞增殖侵袭能力加强[17]。这些研究似乎证明CCDC8是抑癌基因。然而在HBV相关肝细胞癌中，CCDC8基因多态与MKI67表达有关[18]。聂建云课题组在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中干扰CCDC8后，癌细胞的增殖侵袭能力下降，裸鼠成瘤能力下降[19-20]，这又提示CCDC8有促癌作用。在脑转移的乳腺癌中BNC1、GALNT9、CCDC8经常出现表达异常，对同一个患者乳腺癌原发灶和脑转移灶中这三个基因进行对比，发现这三个基因在脑转移灶中甲基化程度高，在原发灶中甲基化程度很低。BNC1和GALNT9甲基化过程发生在乳腺癌进展和转移的后期，而CCDC8的甲基化发生在乳腺癌进展和转移的早期[9]。我们推测CCDC8可能与TGF-β1通路有关，在不同的组织及疾病不同时期发挥不同的作用，既有抑癌作用又有抗癌作用。我们在TCGA数据库中分析CCDC8及TGF-β1在正常癌旁组织中表达较NSCLC组织中表达高，与中国医科大学的研究结果一致[17]。CCDC8可能与TGF-β1信号通路有关，在肿瘤早期发挥抗肿瘤作用。TCGA的鳞癌数据中CCDC8 mRNA1表达与总生存相关；而在腺癌中CCDC8 mRNA1表达与总生存无关；未发现TGF-β1 mRNA表达与腺癌和鳞癌的生存相关。204例病理组织中CCDC8和TGF-β1蛋白表达与非小细胞肺癌生存无关。分层生存分析结果发现CCDC8蛋白高表达、TNM分期晚与鳞癌患者生存期短有关。多因素Cox回归分析CCDC8蛋白表达和TNM分期与鳞癌患者总生存相关。提示我们CCDC8可能是肺鳞癌预后指标。中国医科大学的一项研究在147例非小细胞肺癌组织中检测CCDC8表达，发现CCDC8与癌细胞分化，淋巴结转移有关；是预后好的指标[17]。我们的研究与他们不一致，可能与两项研究病例数较少有关。还需扩大样本量进一步验证。我们的研究与TCGA数据库的数据分析基本一致。

综上所述，在非小细胞肺癌中CCDC8和TGF-β1 mRNA和蛋白的表达均呈正相关，CCDC8可能是肺鳞癌独立预后指标，可能为肺鳞癌的预后判断提供新的参考。是否CCDC8与TGF-1一样在不同的肿瘤及肿瘤的不同时期作用不同，以及CCDC8表观遗传学的变化对肿瘤的作用仍需进一步研究。