猪博卡病毒G1基因群和猪流行性腹泻病毒双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

师乾凯，范慧霞，顾文源,3，侯林杉，左玉柱*，范京惠*

(1.河北农业大学动物医学院，河北保定071001；2.河北农业大学信息科学与技术学院，河北保定071001；3.河北省动物疫病预防控制中心，河北石家庄050035)

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)属冠状病毒属，各年龄猪均易感。猪博卡病毒(Porcine bocavirus，PBoV)，属于细小病毒科、细小病毒亚科博卡病毒，其主要引起猪的腹泻、呼吸系统疾病及仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)，各年龄段猪均易感，在仔猪体现为高发病率和病死率[1-2]，且全球流行。已发现的PBoV 可分为 3 个基因群，命名为 G1、G2 和 G3，同群PBoV 之间同源性较高，而不同群之间则差异较大，目前PBoV 在猪群中主要以PBoV G1 流行为主[3-5]。因此，对PBoV G1 的准确鉴定有助于对该病毒流行情况及致病性的进一步确定。

由于猪在感染PBoV 之后主要症状与PEDV 感染症状极为相似，临床上难以区分，且PBoV 与PEDV 易发生混合感染[6]，因此建立一种特异性强、灵敏度高、耗时短的检测方法对准确检测PBoV 和PEDV 及其流行病学调查等均具有重要意义。目前，针对 PBoV G1 基因群和PEDV 感染的双重TaqMan荧光定量PCR 检测方法尚未报道。因此，本研究根据PBoV G1 基因群和PEDV 的保守基因序列设计了两对特异性引物及探针，建立了能够同时区分PBoV 和 PEDV 的双重TaqMan 荧光定量 PCR 检测方法，为PBoV 和PEDV 感染的检测提供了快速、敏感的方法。

1 材料与方法

1.1 病毒及样品 PBoV HB-HD 株(MG014696)、PEDV BJ2010 株(JF690778)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)HB-BD 株(MF948005)、猪伪狂犬病毒(PRV)CH/HB/BD 株(MG738722)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)CH/HB/YX 株(MG786932)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV) HB06 株(MK166015)、猪轮状病毒(PRoV)JL94 株(AY538664)均由河北农业大学动物医学院动物传染病实验室保存，其中PBoV HB-HD 株(MG01 4696)与 PBoV G1 群代表株 PBo-likeV(FJ87 2544)、Buk8_1(JX854557)和 PBoV-SX(HQ223038)的同源性分别为99.3 %、99.3 %和99.0 %。

142 份腹泻病仔猪的肠道内容物样品，采集自2017 年5 月～2018 年8 月河北省邯郸市、石家庄市、保定市、沧州市以及张家口市等规模化猪场。以上样品加PBS 稀释混匀，经试管分装处理后-80 ℃保存备用。

1.2 主要试剂 DNA/RNA 提取试剂盒购自北京全式金生物科技有限公司；琼脂糖凝胶DNA 纯化回收试剂盒、普通质粒小量提取试剂盒和FastTaqMan Mixture 均购自北京康为世纪生物科技有限公司；反转录试剂盒、DL1000 DNA Marker、pMD19-T 载体均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 引物的设计与合成 根据PBoV(MG014696)NP1 基因和PEDV(JF690778) M 基因的保守区基因序列，利用Beacon designer 7 分别设计2 对特异性引物和探针(表1)。引物和探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 荧光定量PCR 探针及扩增引物Table 1 Primers and fluorescent probes for the real-time PCR

1.4 荧光定量PCR 方法的建立

1.4.1 质粒标准品的制备 按照DNA/RNA 提取试剂盒说明书进行PEDV、PDCoV、PRoV 和TGEV 病毒核酸的提取，按照反转录试剂盒说明书分别对PEDV、PDCoV、PRoV 和 TGEV 的总 RNA 进行反转录为cDNA 后，置于-80 ℃保存备用。

将提取的 PBoV 的 DNA 和 PEDV 的 cDNA 采用PBoV-F/PBoV-R 和PEDV-F/PEDV-R 两对引物分别进行 PCR 扩增。PCR 反应体系 20 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，DNA(cDNA)模板 4 μL，dNTPs(10 mmoL/L)3 μL，TaqDNA 聚合酶(2.5 μmol/μL) 0.5 μL，上下游引物各 1 μL (20 μmoL/L)，ddH2O 8 μL。PBoV 反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃30 s，共35 个循环；72 ℃ 7 min。PEDV 反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、53 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共35 个循环；72 ℃ 7 min。PCR 反应产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳切胶纯化后分别克隆至pMD19-T 载体，PCR 鉴定为阳性的克隆再经测序鉴定。采用Nanodrop 2000 测定质粒的浓度，计算拷贝数，作为质粒标准品。

1.4.2 双重荧光定量PCR 条件优化及标准曲线的建立 利用罗氏LightCycler96 实时荧光定量PCR仪，采用方阵法优化引物、探针浓度，并对双重荧光定量PCR 反应体系进一步优化。

将制备的PBoV 和PEDV 重组质粒标准品分别10 倍倍比稀释(1.0×108拷贝 /μL～1.0×102拷贝 /μL)后做为模板，每个浓度做3 个重复。按照优化后的反应体系，反应条件进行双重荧光定量PCR 扩增，以标准品浓度的对数为X 轴，Ct 值为Y 轴建立标准曲线。

1.5 特异性试验 以提取的PBoV、PRV、PCV2 的DNA 以及反转录所得到的PEDV、TGEV、PRoV 和PDCoV 的cDNA 为模板，利用建立的双重荧光定量PCR 进行扩增，同时设置阴性对照，评估该检测方法的特异性。

1.6 敏感性试验 将PBoV 和PEDV 的质粒标准品10 倍倍比稀释(1.0×108拷贝 /μL～1.0×100拷贝 /μL)后，利用优化后的双重荧光定量PCR 扩增，确定其敏感性，同时应用本实验室建立的单一PCR 方法进行检测，比较分析两种试验结果。

1.7 重复性试验 选取同一批6 个经10 倍倍比稀释(1.0×107拷贝 /μL～1.0×102拷贝 /μL)的质粒标准品作为模板，应用建立的方法进行组内重复试验，其中每浓度重复3 次；在3 个不同时间，对上述6个不同浓度的质粒标准品进行组间重复试验，每个浓度重复了3 次反应。根据Cq 值计算组内、组间变异系数，评估该方法的重复性。

1.8 临床样品的检测 将河北省不同地区采集的142 份仔猪腹泻样品，按照DNA/RNA 提取试剂盒说明书提取其基因组，并将部分基因组反转录为cDNA 后，利用建立的双重TaqMan 荧光定量PCR检测方法进行扩增，同时采用普通PCR 方法检测样品，比较二者的检测结果。

2 结 果

2.1 PBoV 和PEDV 重组质粒标准品的制备 以提取的 PBoV 和 PEDV 核酸作为模板，分别使用PBoV-F/PBoV-R 和 PEDV-F/PEDV-R 两对引物进行PCR 扩增，结果显示得到与预期(PBoV 82 bp 和PEDV 107 bp)相符的基因片段(图1)。PCR 产物克隆至pMD19-T 载体后，经测序比对，与GenBank 登录的相应基因序列完全符合。使用Nanodrop 2000 测定重组质粒浓度，通过公式换算得到浓度分别为2.18×1010拷贝 /μL 的 PBoV 重组质粒和 3.17×1010拷贝 /μL 的 PEDV 重组质粒标准品。

图1 目的基因的PCR 扩增结果Fig.1 Amplification of the target genes by PCR

2.2 双重荧光定量PCR 反应条件的优化结果及标准曲线的建立 优化后的双重荧光定量PCR 反应体系为 25 μL：FastTaqMan Mixture 12.5 μL；PBoV 引物及探针终浓度均为0.2 μmol/L；PEDV 引物及探针终浓度均为 0.2 μmol/L；模板 2 μL；ddH2O 7.5 μL。反应条件为：95 ℃30 s；95 ℃5 s，退火温度为59 ℃30 s，40 个循环，每个循环结束时收集荧光信号。

将PBoV 和PEDV 的重组质粒标准品10 倍倍比稀释后经荧光定量PCR 扩增，建立的标准曲线结果显示两种模板浓度在 1.0×102拷贝 /μL～1.0×108拷贝/μL 范围内，均与其Ct 值具有良好的线性关系，其扩增效率分别为96 %和98 %，相关系数R2均为1 (图2)。

2.3 特异性试验结果 分别以PBoV、PRV、PCV2、PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV 的基因组作为模板，按照建立的双重荧光定量PCR 方法进行扩增，并以无菌水作为阴性对照，结果显示，除PBoV 和PEDV 外，其余病毒及阴性对照检测结果均为阴性(图3)，表明该检测方法具有较强的特异性。

图2 荧光定量PCR 扩增曲线和标准曲线Fig.2 Amplification cure and standard curve of the real-time PCR

图3 荧光定量PCR 的特异性检测Fig.3 Specificity test of the real-time PCR

2.4 敏感性试验结果 将PBoV 和PEDV 的质粒标准品10 倍倍比稀释后，利用优化后的双重荧光定量PCR 进行扩增，结果显示，该方法可以检出的最低PBoV 质粒标准品为 2.18×101拷贝 /μL，最低 PEDV质粒标准品为3.17×101拷贝/μL；普通PCR 显示能检出的最低 PBoV 样品浓度为 2.18×104拷贝 /μL，PEDV 样品浓度为 3.17×104拷贝 /μL (图4)。表明该双重荧光定量PCR 敏感性较高。

2.5 重复性试验结果 利用建立的双重荧光定量PCR 进行组内重复性组间重复性试验，结果显示，组内组间的变异系数均小于4 % (表2)。表明该方法具有良好的重复性。

2.6 临床样品检测 应用建立的双重TaqMan 荧光定量PCR 检测方法对来自河北省的142 份腹泻样品进行检测，结果详见表3。表明PEDV 仍为引起仔猪腹泻的主要病原，同时表明本研究建立的方法可应用于临床检测。

图4 PBoV 和 PEDV 荧光定量 PCR(A)和普通 PCR(B)的敏感性检测Fig.4 Sensitivity test of the real-time PCR (A) and the conventional PCR (B) for PBoV and PEDV

表2 TaqMan 荧光定量PCR 的重复性试验Table 2 The reproducibility test of the TaqMan real-time PCR

表3 临床样品的检测结果Table 3 Detection of clinical samples with the duplex TaqMan real-time PCR

3 讨 论

PBoV 是近年来新出现的一种细小病毒，由于其致病性和病毒结构等与细小病毒存在差异，且在猪群中广泛存在，引起国内外研究人员的广泛关注[7-8]。PBoV 引起感染动物的临床症状与PEDV 极其相似，给疾病诊断及治疗带来了一定困难。有学者报道PBoV 在腹泻猪群中有较高的阳性率(31.2 %)，可以与 PEDV 混合感染[9]。2014 年，Zhang 等学者通过病毒宏基因组学方法对临床腹泻样品进行分析发现，与其它能够引起腹泻的病毒相比，PEDV 与PBoV 在仔猪体内的共感染率最高[6]。因而，建立一种特异性强、灵敏度高的快速检测方法对准确检测PBoV 和 PEDV 十分重要。

目前，用于PBoV 和PEDV 的检测方法主要有PCR、环介导等温核酸扩增(LAMP)、间接免疫荧光(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等[7,10-11]，但LAMP对环境要求高，容易造成假阳性；IFA 和ELISA 成本高，并且有耗时长、灵敏度低等缺点。TaqMan荧光定量PCR 检测方法具有灵敏性高、特异性强、反应快、易操作等特点，同时可以对检测样本进行定量分析。另外，有研究发现TaqMan 荧光定量PCR 和SYBR Green I 荧光定量PCR 相比，前者的检测结果更佳[12]，已经广泛被国内外学者采纳并应用于临床检测。

本实验根据PBoV G1 基因群和PEDV 的保守基因序列，通过对反应体系及反应条件的优化，建立了能够同时检测PBoV G1 基因群和PEDV 的双重TaqMan 荧光定量PCR 方法，该方法特异性强，不与 PRV、PCV2、PDCoV、PRoV、TGEV 发生交叉反应；敏感性优于本实验室所建立的普通PCR 方法；其组内、组间变异系数均小于4 %，重复性好。对2017 年 5 月～2018 年 8 月间，河北省部分地区采集的142 份腹泻样品检测结果显示，PBoV G1 阳性率为 18.3 % (26/142)，PEDV 阳性率为 62.7 %(89/142)，其中PBoV G1 与PEDV 共感染率为10.6%(15/142)。表明PEDV 仍是引起猪群腹泻的主要病原，应引起重视。同时，研究发现在26 份PBoV 阳性的病例中，有57.7 % (15/26)与PEDV 发生混合感染，42.3 % (11/26)单独引起仔猪腹泻，因而还需要从病毒的生物学特性及对机体的致病性等方面入手加强对该病毒的进一步研究。