肠炎沙门菌mreB基因缺失株的构建及其体外生物学特性研究

王曼宇，王忠星，曹 俊，许 秋，刘思国*，于申业*

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/ 动物细菌病研究室，黑龙江哈尔滨150069)

沙门菌是一种具有重要公共卫生学意义的食源性病原菌，其侵入和在宿主细胞内的复制增殖导致一系列疾病，包括肠胃炎、菌血症、肠热和局部感染[1]。MreB 蛋白是维持其细胞形状的蛋白之一，是一种细菌肌动蛋白，其在结构和生物化学上与肌动蛋白类似，MreB 蛋白聚合形成类似于肌动蛋白微丝的纤维，组成细菌的MreB 细胞骨架，后者能够导致细胞壁产生整体性的排布结构，从而决定细菌的菌体形状。细胞骨架在细胞分裂、生长、物质运输等许多生理过程中具有重要作用。另外，在MreB指导下，细菌将构成其细胞壁的原材料自然有序的插入肽聚糖网络结构中形成聚糖链[2]，从而决定了细胞壁的结构。可见，MreB 对于杆状细菌的细胞壁合成与结构完整性具有重要作用。但以往的研究大都以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为模型，而对沙门菌MreB 蛋白的功能尤其是其在侵入宿主和持留过程中的作用知之较少。另一方面，该蛋白对于研究菌蜕疫苗的形成机制也具有重要意义，因为细菌细胞壁合成在其菌蜕形成过程中具有关键作用[3]。本实验利用Red 同源重组系统构建肠炎沙门氏菌的mreB基因缺失株，进一步鉴定该基因对菌株抵抗环境压力能力的影响，为探究MreB 蛋白在沙门菌致病机制中的作用及其在菌蜕形成过程中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 肠炎沙门菌分离株SM6、λRed 重组系统工具载体 pKD46 和 pCP20、大肠杆菌DH5α 和表达载体pETDuet-1 由哈尔滨兽医研究所动物细菌病研究室保存[4]。pKD4 载体由美国华盛顿大学Miller 教授惠赠。

DNA 胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自Omega 公司；PCR 试剂购自TaKaRa 公司。

1.2 引物设计与合成 根据肠炎沙门菌P125109 基因组(NC_011294.1)mreB基因序列和pKD4 载体序列设计引物。引物H1 和H2 分别带有mreB基因两翼40 bp 序列作为同源臂，用于扩增其同源重组序列。在SM6 基因组同源重组部位的外侧设计引物mreBId-F/R，用于同源重组过程中菌株的鉴定，野生型菌株PCR 扩增产物为2 660 bp，卡那霉素基因替换mreB基因后则PCR 产物为3 493 bp，卡那霉素基因片段被消除后则PCR 产物为2 100 bp。引物mreBF/R 扩增mreB基因全长及其上游带有启动子区的307 bp 片段，构建mreB基因回补质粒。引物由苏州金唯智公司合成，序列见表1。下划线表示同源臂，斜体表示酶切位点。

表1 PCR 引物序列Table 1 Primers used in this study

1.3 肠炎沙门菌mreB基因缺失株及回补株的构建按照文献[4]进行。以pKD4 为模板，利用引物H1和 H2 扩增两侧带有mreB基因上下游同源臂的1 595 bp 打靶片段，切胶回收该打靶片段。用L- 阿拉伯糖(终浓度为0.2 %)诱导含pKD46 质粒的肠炎沙门菌 SM6 株，30 ℃培养至 OD600nm约 0.6～0.8，4 ℃离心收集菌体，制备电转化感受态细胞。将100 ng打靶片段电转化至上述感受态细胞中，转化产物涂布于含100 μg/mL 卡那霉素的LB 平板，37 ℃过夜培养。菌落 PCR 筛选mreB基因替换缺失株SM6ΔmreB∶∶Kan。将 pCP20 质粒转入该mreB基因缺失株中，42 ℃培养8 h 以消除卡那霉素基因和pCP20 质粒。最终获得氨苄青霉素和卡那霉素双阴性的mreB基因缺失株，命名为SM6ΔmreB。

扩增肠炎沙门菌SM6 株的mreB基因，NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后纯化，克隆至pETDuet-1 载体，构建回补质粒pET-mreB，转化沙门氏菌SM6ΔmreB感受态细胞，获得回补菌株SM6ΔmreB/pmreB。

1.4 体外生长速率的测定 分别挑取上述亲本株SM6、缺失株和回补株的单菌落，接种于无抗性LB液体中过夜培养后转接于24 孔板，调整菌液初始OD600nm=0.02，37 ℃培养，每小时测定菌液的OD590nm值，连续测14 h，绘制亲本株、缺失株及回补株的体外生长曲线。试验重复3 次。

1.5 扫描电镜观察菌体形态 离心收集SM6、SM6ΔmreB及其回补株的过夜培养物，依次经2.5 %戊二醛和1 %饿酸OsO4固定，再经乙醇梯度脱水，采用50 %叔丁醇和100 %叔丁醇分别置换1 次和2次，之后经真空干燥，镀膜后扫描电镜观察SM6ΔmreB的形态变化。

1.6 高温缺氧应激能力的测定 取上述3 种菌株的过夜培养物，分别接种于10 mL 新鲜LB 液体培养基中，调整初始OD600nm约为0.1。分别于40 ℃5 %CO2培养 12 h。将菌液稀释 10-3倍、10-5倍和 10-7倍3 个浓度，取100 μL 相应浓度的稀释液涂布于固体LB 平板，37 ℃培养12 h，计算菌落数。比较高温缺氧对3 株菌生长的影响。试验重复3 次。

1.7 渗透应激能力的测定 分别挑取上述3 种菌株的单菌落接种于无抗性LB 液体中，过夜振荡培养后，分别转接于 100 mmol/L、200 mmol/L 和 400 mmol/L NaCl 的LB 液体培养基中，调整初始OD600nm约为0.1，37 ℃培养12 h。按照1.6 所述方法进行菌落计数。试验重复3 次。

1.8 耐酸性的测定 分别挑取上述3 种菌株的单菌落，接种于无抗性LB 液体中，过夜振荡培养后，分别接种于 pH7.0、pH6.0 和 pH4.5 的 LB 液体中，调整初始 OD600nm约为 0.1，37 ℃培养 12 h。按照1.6 所述方法进行菌落计数。试验重复3 次。

1.9 统计分析 所有数据采用GraphPad Prism 7 软件进行数据整理，高温缺氧试验结果采用one-way ANOVA 方法分析，其余试验结果采用two-way ANOVA 方法分析。

2 结 果

2.1mreB基因缺失株与回补株的构建与鉴定 以pKD4 质粒为模板，以引物H1 和H2 PCR 扩增出两端分别带有40 bpmreB基因序列、中间为卡那霉素基因片段。将该片段电转化到含pKD46 质粒且经阿拉伯糖诱导的SM6 菌株感受态细胞中，37 ℃培养后 PCR 筛选替换缺失株 SM6ΔmreB∶∶Kan。将 pCP20质粒转入mreB基因替换缺失株中，42 ℃培养后PCR 筛选不含抗性的mreB基因缺失株SM6ΔmreB。构建含mreB基因及其上游带启动子区的回补质粒，转化mreB基因缺失株，得到回补株SM6ΔmreB/pmreB。以鉴定引物mreB-Id-F/R 分别扩增亲本株、替换缺失株和缺失株，以引物mreB-F/R 扩增回补株，PCR 产物依次为 2 660 bp、3 493 bp、2 100 bp 和1 366 bp (图1)。所有结果均经过测序确认正确。表明正确构建了肠炎沙门菌mreB基因缺失株与回补株。

图1 肠炎沙门菌SM6ΔmreB 菌株的构建与鉴定Fig.1 Construction and identification of S.enteritidis SM6ΔmreB strain

2.2mreB基因缺失株的形态学观察 扫描电镜观察可见，SM6ΔmreB株相比于亲本株，mreB基因的缺失导致肠炎沙门菌菌体不再呈短杆状，而是变圆呈球状。回补株则恢复了亲本沙门菌的短杆状表型(图2)。表明mreB基因与维持沙门菌正常形态的骨架结构有关。

图2 3 种菌株的扫描电镜照片Fig.2 Morphology change of SM6ΔmreB under scanning electron microscopy

2.3mreB基因缺失株体外生长速率的测定结果将亲本株、缺失株和回补株在相同条件下培养，每小时检测OD600nm值，绘制生长曲线，结果显示，自培养3 h 开始，缺失株的生长速率即明显低于亲本株(p＜0.05)，自培养6 h 至试验结束，二者差异更加显著(p＜0.01)。回补株在前4 h 内的生长速率与亲本株相当，但至生长中后期速率明显降低(p＜0.01) (图3)。表明mreB基因缺失阻碍了沙门菌的正常生长。

图3 缺失株SM6ΔmreB 的体外生长曲线Fig.3 Growth rate of SM6ΔmreB in vitro

2.4mreB基因缺失株对高温缺氧应激能力的测定结果 将亲本株、缺失株和回补株在40 ℃5 % CO2条件下培养，结果显示，当在高温缺氧压力条件下，SM6ΔmreB的生存能力较亲本株和回补株显著减弱(p＜0.05)，而亲本株和回补株之间无显著差异(p＞0.05) (图4)。表明mreB基因的缺失降低了沙门菌对高温缺氧的耐受能力。

图4 缺失株SM6ΔmreB 对高温缺氧应激能力的测定结果Fig.4 The high temperature/oxygen deficit of SM6ΔmreB

2.5mreB基因缺失株对渗透应激能力的测定结果将亲本株、缺失株和回补株分别培养在不同渗透压条件下，比较mreB基因的缺失对菌株渗透应力的影响。结果显示，随着渗透压的升高，3 个菌株的生长均受到抑制。当在100 mmol/mL 和200 mmol/mL NaCl 中培养时，与亲本株和回补株相比，缺失株生长受到明显抑制(p＜0.05)。在 400 mmol/mL NaCl中，3 个菌株的生长差异不显著(p＞0.05) (图5)。表明mreB基因的缺失在一定程度上降低了沙门菌对高渗透压的耐受能力。

图5 缺失株SM6ΔmreB 渗透应力的测定结果Fig.5 Osmotic stress of mutant strain SM6ΔmreB

2.6mreB基因缺失株耐酸性的测定结果 将亲本株、缺失株和回补株分别在不同pH 值条件中培养，比较mreB基因的缺失对菌株耐酸力的影响。结果显示，在中性和弱酸性环境中，3 种菌株的生存数量无明显差异(p＞0.05)；而当处于强酸性环境中(pH=4.5)时，mreB基因缺失株较亲本株和回补株的生存能力显著降低(p＜0.05) (图6)。表明mreB基因的缺失降低了沙门菌对强酸性条件的耐受能力。

图6 缺失株SM6ΔmreB 耐酸能力测定结果Fig.6 Acid resistance of the SM6ΔmreB

3 讨 论

MreB 是一种古老的蛋白质，其三维结构和保守的活性位点肽序列均类似于真核细胞的肌动蛋白，其功能也与肌动蛋白相类似，因此被称为类肌动蛋白。MreB 蛋白对菌体形状控制非常重要，其能够指导细胞壁生长而产生手性细胞壁结构和决定细胞的直径[5]。在大多数杆状细菌中，MreB 蛋白在细胞膜底下形成螺旋网络结构，引导参与细胞壁生物合成的蛋白进行运动[6-8]。除了维持形状之外，细菌也通过上述螺旋网络结构维持细胞壁的结构完整性。目前的研究大都仅限于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，而对于沙门菌MreB 蛋白的功能研究较少。

本实验构建肠炎沙门氏菌SM6mreB基因缺失菌株及回补菌株，首先对其生长特性和菌体形态等进行了检测。mreB基因的缺失导致肠炎沙门菌的生长受到明显抑制，其生长速率显著低于亲本株。据报道，在大肠杆菌中MreB 密集定位于菌体的圆柱形部分中，而不在极区，MreB 蛋白从空间上调节肽聚糖的合成，使细胞能够双向拉长[9-10]，对细胞极性生长有影响[11-13]。因此本研究推测这是因为mreB基因通过影响细胞的极性生长，从而降低了细菌生长速率。当大肠杆菌mreB基因缺失或使用药物A22 抑制MreB 聚合，将导致大肠杆菌从杆状变成球形[14]。本研究mreB基因的缺失也导致肠炎沙门菌形态发生改变，菌体不再呈短杆状，而是变圆呈球状。其次，检测了肠炎沙门菌mreB基因缺失菌株在不同环境条件中的存活能力。当处在接近细胞溶酶体和胃液的强酸性环境中(pH=4.5)，mreB基因缺失株较亲本株的耐酸性显著降低，表明MreB 蛋白会影响肠炎沙门菌在宿主胃液中或细胞溶酶体中的生存能力。缺失株对环境渗透压力和高温缺氧压力的耐受能力均显著低于亲本株。之前研究表明，当大肠杆菌MreB 缺失或受到抑制时，由于缺乏MreB 的引导，其无法在细胞膜底下形成正常的螺旋网络结构，导致细菌细胞壁结构发生改变，容易发生裂解[14-15]。所以肠炎沙门菌mreB基因缺失株在上述环境压力中存活能力的降低，极有可能是由于其细胞壁产生缺陷的结果。这种缺陷是否会影响其对宿主细胞的侵入和定植能力，以及是否会影响细菌的致病力，值得深入研究。另外，MreB 有可能在菌蜕形成的过程中起重要作用。噬菌体裂解蛋白在细菌外壳造成损伤导致造成细菌空壳即菌蜕，该过程中裂解蛋白会导致细菌细胞壁的合成缺陷[3]，而这是否由裂解蛋白对MreB 功能的抑制所导致，也需要进一步探究。总之，本研究为进一步揭示MreB 蛋白在沙门菌致病机制以及菌蜕形成过程中的作用奠定了基础。