锚定表达猪IFN-λ3重组植物乳杆菌的构建及其抗PEDV效果的检测

刘永仕，刘 琼，赵 唯，黄海斌，石春卫，姜延龙，杨桂连，王春凤

(吉林农业大学动物科学技术学院/ 吉林省动物微生态制剂工程研究中心，吉林长春130118)

干扰素(Interferon，IFN)是动物细胞受到病毒感染，或受细菌内毒素、核酸等作用后，由受体细胞分泌的一种具有生物学活性的可溶性糖蛋白，其在早期免疫应答中具有抗病毒、抑制肿瘤形成及免疫调节等多种生物学功能[1]，根据其生物活性分为IFN-Ⅰ、IFN-Ⅱ、IFN-Ⅲ[2]。其中 IFN-Ⅲ家族的功能性受体复合物是由IL-28Ra 和IL-10Rβ 组成的异二聚体型细胞因子受体，此种受体高表达在黏膜器官表面(包括呼吸系统和胃肠道)[3]。所以，IFN-Ⅲ在粘膜免疫中起重要作用，相比IFN-I 更具有靶向性。IFN-Ⅲ又分为 IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3、IFN-λ4[4-5]，其中，人有 4 种(IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3、IFN-λ4)；鼠有两种(IFN-λ2、IFN-λ3)；但在猪体内仅发现两种(IFN-λ1、IFN-λ3)能被克隆和表达[6-7]。

乳酸菌作为一种能够发酵碳水化合物的革兰氏阳性菌，具有益生功能[8]。植物乳杆菌(L.plantarum)的高疏水性、自聚性、黏附性使得该菌具有在肠道定植的能力，成为肠道优势菌群[9]，并具有免疫调节活性[10]。在机体感染肠道致病菌时，植物乳杆菌通过对病原菌必需生长物质的掠夺及黏附作用的排斥来抑制其侵入和定植[9]。Kawashima 等证实植物乳杆菌还有预防病毒感染的效果[11-13]。

猪流行性腹泻(PED)是由α 冠状病毒引起的一种急性肠道传染病，该病发病率和死亡率较高，导致养猪业严重的经济损失[14]。PED 病毒(PEDV)主要感染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)，导致明显的绒毛萎缩，并伴有水样腹泻，呕吐和厌食症状。虽然我国有几种商品化PEDV 疫苗，但从2011 年PED 一直在我国持续存在[15]。在体外和体内实验中，IFN-λ已经被证明能够抑制多种病毒的复制，而乳酸菌也有抗病毒效果[16]，因此本研究用含锚定序列pgsA'的 pSIP-409 质粒系统[9]构建锚定表达猪 IFN-λ3 的重组植物乳杆菌，体外刺激猪IPEC-J2，研究其抗PEDV 效果，为新功能型乳酸菌制剂开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 分离自青贮饲料的植物乳杆菌NC8 和pSIP-409-pgsA'-EGFP 质粒，均由吉林省动物微生态制剂工程研究中心保存。大肠杆菌TOP10 感受态细胞购自康为世纪生物科技有限公司。PEDV由本实验室分离鉴定并保存。IPEC-J2 购自丰晖生物科技有限公司。

质粒高纯度小提试剂盒、快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、快速DNA 产物纯化试剂盒、5×SDS-PAGE Loading Buffer、山羊抗小鼠IgG-FITC 均购自康为世纪生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBRPremix ExTaqTMII、高保真PCR 酶、限制性内切酶、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、DL10000 DNA Marker 均购自宝生物工程(大连)有限公司；鼠源抗6×His-tag 单克隆抗体(MAb)购自艾美捷公司；山羊抗小鼠IgG-HRP 购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；病毒RNA 提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。总RNA 提取试剂盒购自OMEGA公司。

1.2 重组猪 IFN-λ3 植物乳杆菌的制备 参照GenBank 中 IFN-λ3 基 因 序 列 (GQ996936.1)设 计 引物，扩增不含信号肽序列的猪IFN-λ3 基因，其上、下游引物分别是：F2：GAATCTAGAGTTCCAGTTC CGGAGGC (XbaⅠ )/R2： CGCAAGCTTTTAATGAT GGTGATGATGGTG (Hind Ⅲ)。胶回收 PCR 产物后经XbaⅠ/Hind Ⅲ双酶切，利用DNA 纯化回收试剂盒进一步纯化后克隆至载体pSIP-409-pgsA'，构建重组质粒pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3，采用质粒小提试剂盒提取该重组质粒后酶切鉴定并测序。

将鉴定正确的重组质粒pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3在冰浴条件下电转化植物乳杆菌NC8 感受态细胞(100 μL)，于含终浓度 0.5 mol/L 蔗糖的 MRS 培养液中30 ℃厌氧培养3 h 后，取200 μL 在含终浓度0.01 mg/mL 红霉素的MRS 固体培养基上均匀涂布，37 ℃厌氧培养。

1.3 重组植物乳杆菌的诱导表达及检测 挑取1.2中单菌落，接种至含终浓度0.01 mg/mL 红霉素的MRS 培养基，37 ℃厌氧培养至 OD600nm达到 0.2 左右时，经终浓度50 ng/mL 的清酒乳杆菌素(SPPIP)诱导 3 h (OD600nm达到 0.8)，收集 pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3/L.plantarum菌液 2 mL，5 000 r/min 离心 5 min，收集菌体沉淀，加入1 mL 含1 mg/mL 溶菌酶和0.1 mg/mL RNase 的TES 溶液重悬，37 ℃水浴30 min。2 500 r/min 离心10 min，收集沉淀，TES 洗涤后重悬于500 μL ddH2O 中反复冻融。于4 ℃以21 000 r/min离心1 h，沉淀部分以100 μL ddH2O 重悬，即为细胞膜组分[14]。以鼠源抗 6×His-tag MAb(1∶1 000)为一抗，山羊抗鼠 IgG-HRP (1∶2 000)为二抗，对该细胞膜蛋白进行western blot 检测。同时，取诱导后的pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3/L.plantarum菌液 1 mL，离心后以PBS 洗涤沉淀3 次后重悬，以6×His-tag MAb(1∶500)为一抗， 山羊抗小鼠 IgG-FITC (1∶1 000)为二抗，进行间接免疫荧光(IFA)检测。

1.4 重组植物乳杆菌的抗病毒活性检测

1.4.1 重组植物乳杆菌对IPEC-J2 活力的影响 将IPEC-J2 于96 孔板培养至细胞80 %汇合度时，每孔分别加入 105cfu、2×105cfu、3×105cfu、4×105cfu的 pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3/L.plantarum，37 ℃培养 6 h后用含终浓度0.5 mg/mL 的庆大霉素细胞维持液洗涤一遍，含1 %双抗(10 000 U/mL Penicillin,10 000 μg/mL Streptomycin)的细胞维持液洗涤两遍，确保显微镜下无残余乳酸菌。每孔加入20 μL，5 mg/mL 的 MTT，37 ℃避光孵育 4 h，弃掉培养基，每孔加入150 μL DMSO，振板10 min。同时设对应浓度的植物乳杆菌NC8 孔为对照，检测各孔OD492nm值，分析重组植物乳杆菌对细胞活力的影响。

1.4.2 荧光定量PCR (qPCR)检测重组植物乳杆菌对PEDV 复制影响 待IPEC-J2 细胞铺于48 孔板中生长至80 %汇合度时，加入105cfu 诱导后的重组乳酸菌 pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3/L.plantarum，培养 2 h和 6 h 后分别加入 100 μL 100 TCID50的 PEDV，37 ℃孵育36 h。同时设维持液组、105cfu 植物乳杆菌NC8 组为对照。分别收集3 组细胞的上清液，利用病毒RNA 提取试剂盒提取细胞培养上清中总RNA，测定浓度，反转录获得cDNA 后利用本实验室前期建立的qPCR 方法(未发表，读者需要可提供)检测各组细胞上清中PEDV 的病毒载量，分析重组菌的抗病毒效果。

1.4.3 重组植物乳杆菌诱导细胞抗病毒基因的检测按照1.4.2 中方法设置维持液组、105cfu 的NC8 组和 105cfu 诱导后的 pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3/L.plantarum组，培养2 h 后提取细胞总RNA，反转录获得cDNA，参照文献[17]相对定量qPCR 方法检测干扰素刺激基因(ISGs) 2'-5' 寡聚腺苷酸合成酶(OASL)基因和干扰素诱导跨膜蛋白3 (IFITM3)基因相对转录水平，分析 pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3/L.plantarum的抗病毒活性。

2 结 果

2.1 重组质粒pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3 的构建与鉴定 将该重组质粒经XbaⅠ、Hind Ⅲ双酶切鉴定，结果显示，在约6 000 bp 和500 bp 处可见两条目的条带，与预期相符(图1)，测序分析结果与预期一致。表明正确构建了重组质粒pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3。

图1 重组质粒pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3 的酶切鉴定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3 by restriction enzyme digestion

2.2 IFN-λ3 在重组植物乳杆菌细胞膜上表达的western blot 检测结果 利用反复冻融法获得细胞膜蛋白，western blot 检测重组蛋白IFN-λ3 的膜表面表达情况，结果显示在40.4 ku 处可见清晰蛋白条带，与预期相符(图2)。表明猪 IFN-λ3 在重组植物乳杆菌上锚定表达。

图2 重组IFN-λ3 蛋白在重组植物乳杆菌中表达的western blot 检测(His 标签单克隆抗体)Fig.2 Detection of recombinant IFN-λ3 protein expression from the recombinant L.plantarum by western blot with His-tag monoclonal antibody

2.3 IFN-λ3 在重组植物乳杆菌中表达的IFA 检测结果 通过倒置荧光显微镜观察，在重组菌表面有明显的绿色荧光，而对照组植物乳杆菌NC8 则无荧光(图3)。进一步表明猪 IFN-λ3 在重组菌表面锚定表达。

图3 重组IFN-λ3 在植物乳杆菌表面锚定表达的IFA 鉴定Fig.3 Detection of the fluorescence intensity of the expressed IFN-λ3 on the surface of the recombinant L.plantarum by IFA

2.4 重组植物乳杆菌对IPEC-J2 活力影响的检测采用不同浓度的重组植物乳杆菌刺激细胞6 h，通过MTT 法测量各孔OD492nm值，结果显示重组植物乳杆菌实验组与植物乳杆菌NC8 对照组OD492nm值的比值差异不显著(图4)。表明pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3/L.plantarum对 IPEC-J2 细胞细胞活性无影响。

图4 植物乳杆菌NC8 和pSIP409-pgsA'-IFN-λ3/L.plantarum 对 IPEC 的细胞活性影响Fig.4 The effection of L.plantarum NC8 and recombinant pSIP409-pgsA'-IFN-λ3/L.plantarum on the IPEL-J2

2.5 重组植物乳杆菌对PEDV 病毒复制影响的检测结果 将诱导后的植物乳杆菌NC8 和pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3/L.plantarum(105cfu)与 IPEC-J2 作用 2 h和6 h 后感染PEDV，qPCR 检测结果显示，作用2 h时，pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3/L.plantarum显著抑制PEDV的RNA 转录水平(0.01＜p＜0.05)，而植物乳杆菌NC8对其也有一定的抑制作用；在作用6 h 时，pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3/L.plantarum无明显抑制 PEDV 复制的作用，与对照组相比较差不明显(图5)。表明该重组植物乳杆菌可以显著抑制PEDV 在IPEC-J2 中的复制，且该重组菌与细胞作用2 h 抑制作用较佳。

图5 pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3/L.plantarum 抑制 PEDV 复制的检测结果Fig.5 Inhibition of PEDV replication in IPEC stimulated with L.plantarum NC8 or pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3/L.plantarum for 2 h and 6 h

2.6 重组植物乳杆菌诱导细胞抗病毒基因表达的检测结果 通过 qPCR 检测 IPEC-J2 经 pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3/L.plantarum刺激后 ISGs 基因 OASL 和IFITM3 的相对转录水平。结果显示，在表达猪IFN-λ3 的重组植物乳杆菌刺激下，OASL 和IFITM3的相对转录水平均明显上调(p＜0.05) (图6)。表明该重组植物乳杆菌可以通过刺激IPEC-J2 抗病毒基因的相对表达量上调，发挥抑制病毒复制的作用。

图 6 pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3/L.plantarum 诱导细胞抗病毒基因OASL 和IFITM3 基因的检测结果Fig.6 Relative transcription levels of antiviral genes of OASL and IFITM3 after stimulation of the cells with L.plantarum NC8 and recombinant pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3/L.plantarum

3 讨 论

植物乳杆菌表达载体早期大多使用组成型启动子，但由于这种载体表达的蛋白量难以控制，且易使宿主产生免疫耐受，Sorvig 等构建了诱导型pSIP系列质粒，它具备大肠杆菌源的pUC (pGEM)和植物乳杆菌源的256rep 两个复制子，因此其可以在大肠杆菌中复制并在植物乳杆菌中表达外源蛋白[18]，该载体其宿主菌所表达的外源蛋白主要分泌于细胞质内[19]，乳酸杆菌的细胞壁极大阻碍了胞内蛋白作用的发挥。锚定表达相比分泌表达和胞内表达更具优势，其可以减少蛋白质在恶劣环境中的稀释和降解，使之能够更好地发挥生物学活性。聚-γ- 谷氨酸合成酶A (pgsA)来自于枯草芽孢杆菌，其N 端存在一个跨膜区，为其表面展示创造了条件[9]，可以将外源蛋白锚定在宿主菌表面。根据其蛋白结构和锚定特性，将pgsA 截短为pgsA' 增加锚定效率。因此本实验室基于pSIP-409 载体，构建含有枯草芽孢杆菌的pgsA' 的锚定表达载体pSIP-409-pgsA'。本研究将猪IFN-λ3 连入该锚定表达载体，电转化该重组质粒至植物乳杆菌NC8 中获得重组植物乳杆菌pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3/L.plantarum，通过 western blot、IFA 检测猪IFN-λ3 在宿主菌细胞表面的表达。

研究表明，植物乳杆菌产生的细菌素、细菌素样物质、短链脂肪酸和多糖等物质可以干扰病毒感染中重要的酶促反应，而且细菌可以直接与它们捕获的病毒颗粒相互作用，竞争细胞膜表面的受体，达到抑制病毒复制的作用[20]。随着对益生菌的不断了解，对其抗病毒机制的相关研究也更系统，抗病毒益生菌菌株的筛选为探索其对抑制动物病毒的研究提供了新途径。Virginia 等发现人乳乳酸菌对1 型人免疫缺陷病毒有抑制作用[20]。Sirichokchatchawan等发现猪源乳酸菌的菌体和培养上清对PEDV 的感染具有抑制作用[16]。本研究在抗病毒实验中，通过qPCR 检测发现植物乳杆菌NC8 组与空白对照组相比也会有一定程度的减轻病毒复制的作用。通过相对定量qPCR 发现植物乳杆菌NC8 组与空白对照组相比，IFITM3 基因的相对转录水平有升高的趋势，表明植物乳杆菌NC8 天然有一定程度抗PEDV 复制的作用。

越来越多的证据表明IFN-Ⅲ在上皮组织抗病毒初期起着重要的防御作用。呼吸道、泌尿生殖道和胃肠道是体内主要的粘膜区域，在粘膜表面，当上皮细胞受到病毒的连续攻击后，病毒颗粒配体与模式识别受体结合，并诱导表达特定的转录因子，使IFN-Ⅲ基因表达并释放。IFN-Ⅲ通过Jak-STAT 通路抑制病毒的感染和复制，上调通路下游的ISGs 表达,使邻近健康细胞进入抗病毒状态。Li 等发现原核表达的猪IFN-Ⅲ不仅具有强大的抑制 PEDV 在IPEC-J2 复制的活性，而且可以显著诱导ISGs 的表达[17]。ISGs 表达产物与抗病毒过程直接相关：OAS可以被病毒复制中产生的dsRNA 激活，并活化RNA 酶L[17]；IFITM3 的抗病毒活性与其S- 棕榈酰化修饰有关[21]。本研究将重组植物乳杆菌pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3/L.plantarum刺激细胞，通过 qPCR 证实了该重组植物乳杆菌可以减少PEDV 感染细胞上清液中病毒RNA 的拷贝数，抑制PEDV 在IPEC-J2 中的复制，并能诱导ISGs (OASL、IFITMs)的RNA 相对转录水平的升高，与上述研究结果相符。

目前，猪Ⅰ和Ⅱ型IFN 的抗病毒作用在动物疾病防控中的研究已经取得很大进展，但对于猪IFN-Ⅲ的研究甚少。本研究首次将猪IFN-λ3 锚定表达植物乳杆菌NC8 的表面，使IFN-λ3 更容易与肠上皮细胞受体结合，激活Jak-STAT 通路抑制病毒的感染和复制。本实验从细胞水平上证实了相比植物乳杆菌 NC8，表达了猪 IFN-λ3 的重组L.plantarum抑制PEDV 效果更好。本研究为抗病毒生物制剂的研制，以及PEDV 的预防和治疗提供可行方案。