盐酸特比奈芬凝胶微生物限度的检查方法及效果

李雪杰 杨铁兵 蔻友嫔

盐酸特比萘芬凝胶为广谱抗真菌药物，能高度选择性地抑制真菌麦角鲨烯环氧化酶，阻断真菌细胞膜形成过程中的麦鲨烯环氧化反应而干扰真菌固醇的早期生物合成，从而发挥抑制和杀灭真菌作用。通过实施生物限度检查，合理解决盐酸特比蔡芬乳膏中抑菌成分的干扰问题，能够准确、真实且有效反映药物中存活污染的菌落数，而且检出率较高。

取凝胶中的卡波姆（丙烯酸交链聚合物）及氯化钙（钡）结合形成钙（钡）盐沉淀，最终保证凝胶顺利通过微孔滤膜，避开沉淀物，达到破胶目的[1]。取1∶20 破胶，在经对实验条件筛选后，供试液1 ml稀释后过膜，同时分次取900 ml 冲洗剂进行冲洗， 使加菌回收获得满意果，并有效去除盐酸特比奈芬凝胶抑真菌成分[2-3]。

1 材料与方法

1.1 材料

验证菌的种类：大肠埃希菌CMCC（B）44 102、白色念珠菌CMCC（F）9 8001、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、枯草芽抱杆菌CMCC（B）63 501、黑曲霉CMCC（F）98003。稀释剂及培养基的选择：胆盐乳糖培养基（BL）、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、营养琼脂培养基、pH7.0 无菌氯化钠-蛋白脉缓冲液。改良浓度为0.9%的无菌氯化钠溶液，马丁琼脂培养基。

样品：经广西康华药物有限公司提供的盐酸特比奈芬凝胶。

实验仪器的准备：选择六联开放式薄膜过滤器、天平、电动吸引器冰箱、高压灭菌锅以及培养箱、离心机等。

1.2 方法

1.2.1 制备供试液 取十四烷酸异丙酚30 ml，以及10 g 样品，摇散、保温。同时把保温的pH 7.0 无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液加入其中，温度为45 ℃，之后稀释为100 ml，萃取并振摇。静置分层后，取1∶10供试液的下层水相[4]。

1.2.2 制备菌液 培养18～24 h 的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽抱杆菌的肉汤培养物于35 ℃温度下培养，同时要制备成菌悬液，取0.9%无菌氯化钠溶液进行制备，会有50～100 cfu 的菌落数存在于每毫升的菌悬液中，留作备用[5]。同时培养24～48 h 0.9%无菌氯化钠溶液制备成菌悬液，在25 ℃温度下培养，为白色念珠菌液体培养物，同时会有50～100 cfu的菌落数存在于每毫升的菌悬液中，留作备用。将0.9%的无菌氯化钠溶液3～5 ml 加入到培养了5～7 d的黑曲霉斜面培养物中，在25 ℃的温度下进行培养，洗掉霉菌的袍子，在制备成菌悬液时，需吸取浓度为0.9%的无菌氯化钠溶液，会有50～100 cfu 的菌落数存在于每毫升的菌悬液中，留作备用。

1.2.3 检验方法 供试品对照组：需在平皿中加入等量的供试液，之后即刻将琼脂培养基加入到平皿中，等到凝固发生之后设置出规定的温度，细菌需培养24～48 h，霉菌及酵母菌需培养48～72 h，制备2 个平皿，并测定供试品的本底菌数，进行平行实验[6]。（cfu 为菌落形成单位）

观察组：需在平皿中把50～100 cfu 的试验菌及供试液加入，之后即刻将琼脂培养基加入到平皿中，等到有凝固发生之后培养霉菌及酵母菌48～72 h，设置规定好的温度，细菌培养24～45 h，并实施平行培养，制备2 个平皿。

稀释剂对照组：需选择1 ml 的pH 为7.0 无菌氯化钠—— 蛋白胨缓冲液，以及50～100 cfu 的试验菌，分别进行实验，将其注入到平皿中。观察稀释剂是否会干扰到试验，另外此组各试验菌回收率需高于70%[7]。

菌液组：需在平皿中将50～100 cfu 的试验菌加入其中，之后需把琼脂培养基加入到平皿中，等到有凝固发生之后培养霉菌及酵母菌48～72 h，设置规定好的温度，细菌培养24～45 h，并实施平行培养，制备2 个平皿。

1.2.4 试验实验方法 培养基稀释法：在50～100 cfu/ 皿菌液，以及平皿（0.5 ml/皿、0.2 ml/皿）中，分别取1∶10 的供试液取0.2 ml、0.5 ml 分别注入，之后各制备出2 个平行皿，即刻将15～20 ml 的琼脂培养基加入到平皿中，当有凝固发生之后培养霉菌及酵母菌48～72 h，设置规定好的温度，细菌培养24～45 h，并实施计数，实现对试验菌回收率的测定。

常规法：需在平皿中分别把1 ml 的供试液及50～100 cfu 的菌液加入其中，制备出平行的皿2 个，之后需即刻将15～20 ml 的琼脂培养基加入到平皿中，当有凝固发生之后培养霉菌及酵母菌48～72 h，设置规定好的温度，细菌培养24～45 h，并实施计数，实现对试验菌回收率的测定。

薄膜过滤法：需在50 ml 的稀释剂中将1∶10 供试液10 ml 加入其中，混匀并稀释，取薄膜过滤法冲洗、过滤，0.1%的蛋白胨溶液是主要选择的冲洗液，同时需把50～100 cfu 的试验菌加入到最后一次冲洗液中，细菌数在经取出已经冲洗的滤膜，贴到营养琼脂平板上，同时要把玫瑰红钠琼脂平板上贴上霉菌及酵母菌[8]。养霉菌及酵母菌48～72 h，设置规定好的温度，细菌培养24～45 h，并实施计数，实现对试验菌回收率的测定。

2 结果

2.1 实验平均回收率结果

通过培养基稀释法（0.2 ml），金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌回收率均大于70%；稀释 对照组各试验菌回收率须＞70%；通过薄膜过滤法（冲洗量300 ml），发现黑曲霉及白色念珠菌回收率均＞70%；可选择培养基稀释法（0.2 ml）实现细菌数计数，酵母菌及霉菌计数均选择薄膜过滤法（冲洗量300 ml）。见表1。

表1 实验平均回收率结果(%)

2.2 对比实验平均回收率结果

3 批样品5 种试验菌回收率均＞70%。见表2。

表2 对比实验平均回收率结果(%)

3 讨论

盐酸特比奈芬凝胶是一种新型广谱抗真菌药物，按照我国药典微生物限度检查法有关规定，在对其进行验证中，在建立有关微生物限度检查法时，发现盐酸特比奈芬凝胶微生物限度检查方法的杀灭真菌作用及品种抑制均很强，尤其对于黑曲霉，具有更加显著的作用。在检查关于含有抑菌成分药物的微生物限度时，要求需把供试品自身含有抑菌作用，在试验条件下有效排除掉，被检微生物可实施正常生长繁殖，保证不干扰染菌的限度检验[9-10]。细菌、酵母菌、真菌计数方法，验证试验菌回收率均＞70%。本研究在检验盐酸特比奈芬凝胶微生物限度中，实验时分别选择常规法、培养基稀释法、薄膜过滤法3 种方法。本研究结果显示，通过培养基稀释法（0.2 ml），金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌回收率均大于70%；稀释对照组各试验菌回收率须＞70%；通过薄膜过滤法（冲洗量300 ml），发现黑曲霉及白色念珠菌回收率均＞70%；可选择培养基稀释法（0.2 ml）实现细菌数计数，酵母菌及霉菌计数均选择薄膜过滤法（冲洗量300 ml）。经结果显示发现，3 批样品5 种试验菌回收率均＞70%。同时，药物中存活的污染的菌落数，可准确、真实地反映出来，并具有较高的检出率。

综上所述，在进行霉菌及酵母菌检查中，选择盐酸特比奈芬凝胶薄膜过滤法，另外在进行细菌数的检查中，选择培养基稀释法，得出的结果可靠，方法可行。