结肠腺癌组织MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表达及意义

张宗祥 杨 翀 方迪龙 李 科

结肠腺癌是肠黏膜上皮呈腺样分化的一种恶性上皮性肿瘤，病变发生与遗传及饮食等因素有关[1]。腺癌常伴有淋巴道转移，一般预后较差，与病变形成时的浸润及播散有关[2]。近年研究认为，肿瘤细胞播散时可以产生转移相关蛋白[3]。MMPs 家族是与转移相关的蛋白，能对细胞外基质成分形成降解，破坏肿瘤转移的屏障，肿瘤细胞易于离开原灶，形成播散。基质金属蛋白酶-11（MMP-11）和基质金属蛋白酶-12（MMP-12）是近年发现的与转移密切相关的蛋白，二者可能与脉管生成相关[4]。血管内皮生长因子-D（VEGF-D）被认为是淋巴管生成的促进因子，通过其受体血管内皮生长因子受体3（VEGFR3）促进间质淋巴管内皮细胞增殖并介导淋巴管新生[5]。笔者应用流式细胞术检测结肠腺癌组织MMP-11、MMP-12和VEGF-D 表达，分析其相关性及对预后判断的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012 年9 月—2014 年8 月在浙江省中西医结合医院普外科就诊并进行手术治疗的结肠腺癌患者130 例为研究组。选择上述患者术后标本距肿物边缘>3cm 的正常结肠黏膜组织130份作为对照组。术后标本均由病理主治医师以上职称人员进行取材，严格按诊疗规范进行操作。本研究经医院伦理委员会审核通过，纳入病例均由患者或家属签属知情同意书。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：（1）由病理医师进行复核切片，并按WHO 结肠腺癌的诊断标准作为依据，明确分型；（2）原发腺癌且为首次发病就诊的患者。排除标准：（1）伴有其它器官恶性肿瘤；（2）有消化道手术史者；（3）术前行放、化疗的患者；（4）有风湿免疫性疾病及先天发育异常的患者。

1.3 流式细胞检测 应用流式细胞术检测两组术后新鲜标本MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 的表达。新鲜标本立即取材后应用75%酒精固定24h 以上，用剪刀将组织剪成浆糊状，进行过滤，去除杂质后离心（2000r/min，10min），取沉淀物，制备单细胞悬液（1×106/mL），取1mL，严格按实验步骤依条件加一抗、PBS 和二抗后，应用美国BD 公司生产的流式细胞仪上机检测，应用系统自带的软件进行数据分析。流式细胞结果判定：实验结果应用荧光指数（F I）表示，FI计算方法：

1.4 Western Blot 检测方法 应用Western Blot 法检测20 份结肠腺癌和20 份距肿物边缘＞3cm 正常结肠黏膜组织MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表达。具体方法：各取适量组织加裂液和PMSF 匀质裂解后离心取上清液提取蛋白，用BCA 法测定蛋白浓度；放入100℃水浴锅内煮5min，配制10%SDA-PAG凝胶，每孔加适量蛋白和Loading Buffer 混合液，电泳分离，之后将蛋白（MMP-11、MMP-12 和VEGFD）和GAPDH 的胶段切下转移到PVDF 膜上，封闭60min，加入20mL 抗体（MMP-11 为1：500、MMP-12为1：400、VEGF-D 为1：1000）和20mL 一抗稀释液，4℃过夜，次日洗膜，加入二抗，室温1h 后洗膜，用ECL 发光液进行显影。

Western Blot 结果判定：用Image J 行灰度分析，以目的蛋白灰度值与GAPDH 灰度值的比值为其相对表达量。

1.5 统计学方法 应用SAS6.12 进行处理，依据条件对数据行卡方检验、t 检验、方差分析、生存分析和线性相关性检验，检验水平a=0.05。

2 结 果

2.1 临床资料及病理特征 本组130 例，男69 例，女61 例，年龄38～85 岁，平均（63.0±7.9）岁，中位年龄59 岁；其中高分化23 例，中分化20 例，低分化87例；浸润未超过肌层者45 例，浸润超过肌层者85例；有脉管浸润者35 例，无脉管浸润者95 例；有淋巴结转移31 例，无淋巴结转移99 例。

2.2 结肠癌组织与正常结肠黏膜组织MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表达量比较 同一病例不同部位标本分组，两组MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表达量差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 结肠癌组织与正常结肠黏膜组织MMP-11、MMP-12和VEGF-D 表达量比较（x±s）

2.3 研究组不同临床及病理特征分组MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表达量比较 研究组MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表达量与脉管浸润、浸润深度和淋巴结转移相关，MMP-11、MMP-12 表达量与细胞增殖指数相关。三者与分化程度无明显相关性。见表2。

2.4 Western Blot 法 检 测MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表达 20 份结肠腺癌组织MMP-11 平均表达量（0.98±0.21），20 份正常结肠黏膜组织平均表达量（0.21±0.01）；结肠腺癌组织MMP-12 平均表达量（0.83±0.11），正常结肠黏膜组织平均表达量（0.29±0.25）；结肠腺癌组织VEGF-D 平均表达量（0.81±0.20），正常结肠黏膜组织VEGF-D 平均表达量（0.18±0.03）。经统计学分析，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

表2 研究组不同临床及病理特征与MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表达比较（x±s）

图1 Western Blot 法结果图

2.5 研究组MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表达相关性分析 应用线性相关性分析，结果显示，MMP-11 和VEGF-D （r=0.39，P=0.0313）、MMP-12 和VEGF-D（r=0.43，P=0.0213）具有正相关性。见图2-3。

图2 MMP-11 和VEGF-D 相关性

图3 MMP-12 和VEGF-D 相关性

2.6 研究组MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表达与生存时间的关系 研究组患者随访生存时间8～60个月，平均36.4 个月，经生存分析显示，MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 的表达与生存时间相关（P＜0.05）。即MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 高表达患者生存时间短，预后差；MMP-11、MMP-12 和VEGF-D低表达患者生存时间长，预后好。见图4-6。

图4 MMP-11 表达生存分析

图5 MMP-12 表达生存分析

图6 VEGF-D 表达生存分析

3 讨 论

结肠腺癌发生与各种基因谱系如癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因与转移相关基因的异常改变有关，转移相关基因异常表达是进展期结肠腺癌中的分子病理因素[6]。肿瘤镜下形态主要由腺管状、腺泡状或乳头状结构构成，也可以表现为不相粘着的单个细胞构成（弥漫状分布），肿瘤细胞广泛浸润或隐匿在结肠肠壁的各层，上皮细胞的异型性明显，伴有不同程度的分化。MMP-11 和MMP-12 是分泌家族转移相关蛋白MMPs 家族中的两个重要成员，具有高度保守的锌离子依赖蛋白水解酶[7]。MMP-11 主要是经过细胞外的水解后活化，以活性酶的形式存在，能对肿瘤细胞间质的纤维和基质的改建起一定的作用[8]。有研究认为，MMP-11 能调节血管或淋巴管内皮细胞的生长，促进间质的淋巴细胞聚集和巨噬细胞反应[9]。MMP-12 是由活化的炎细胞和恶性肿瘤细胞分泌，白细胞介素、肿瘤坏死因子、血管内皮生长因子及血小板活化因子等均可以介导MMP-12 的表达，而MMP-12 在正常组织不表达[10]。MMP-12 有广泛的底物活性，能分解弹性蛋白、IV 型原和层粘连蛋白，并对肿瘤间质的纤维组织有明显的降解作用[11]。VEGF-D 是新发现的淋巴管生成促进因子，在高迁移肿瘤的进展时，肿瘤细胞可以产生大量的VEGFD，引起间质中淋巴管内皮细胞的增生，新形成的脉管呈枝芽状生长，在物理性条件作用下，在新生肿瘤的间质处形成管腔，与原淋巴管连接，具有脉管的播散功能，也为肿瘤细胞迁移提供了原始通道[12-13]。

本实验结果显示，研究组MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表达明显高于对照组，提示三者具有癌基因样作用，MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 是肿瘤形成和进展中的重要促进蛋白。实验也显示出流式细胞术和Western Blot 两种半定量检测结果表达的一致性。研究组MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 表达量与脉管浸润、lauren 分型和淋巴结转移相关，提示两者是与肿瘤迁移和播散相关的重要蛋白。MMP-11和MMP-12 的表达与细胞的增殖指数相关，提示两者具有促进肿瘤细胞增生和繁殖的作用。由于以上因素均为与患者生存时间（预后）相关的临床及病理指标，因此三者高表达可能与患者的生存时间或预后相关，而预后分析直接证实了此结论。研究组MMP-11 和VEGF-D、MMP-12 和VEGF-D 表达具有正相关性，提示MMP-11 和MMP-12 均可能促进VEGF-D 的表达[14]，诱导淋巴管生成。但是MMP-11和MMP-12 在血管生成调节过程中的通路作用可能不确切。MMP-11、MMP-12 在肿瘤进展期中的表达升高，即随着肿瘤进展MMP-11 和MMP-12 分泌增加，引起肿瘤细胞生长和分化，细胞异型性明显，增殖活跃，并能对P53 和ras 等基因进行调控，促进肿瘤细胞的迁移和播散[15-16]。MMP-12 具有多种生物学功能，通过识别ECM 及细胞膜上免疫蛋白超家族黏附分子、细胞间黏附分子等介导肿瘤细胞的黏附作用，并引起细胞信号传导异常及调节细胞生存和增殖[17-18]。MMP-11 在腺上皮恶性转变过程中还可能通过对WNT 和PI3K 的信号通路进行调节起作用，由于MMP-11 本身是一种分泌蛋白，其产生后不仅在细胞质中表达，还可以分泌到细胞外液体环境中，即在血液和组织液中可以检测MMP-11 表达，因此血清中可以检测出MMP-11 表达，其与组织中的表达可能有一定的一致性[19]。VEGF-D 被认为可能与MMP-11 和MMP-12 有协同作用的因子，MMP-11和MMP-12 可能是上游基因，调节VEGF-D/VEGFR3 等信号通路，引起细胞增殖和迁移，但是它们是否能作为淋巴管生成的直接通路有待更多实验证实。

总之，MMP-11、MMP-12 和VEGF-D 在结肠腺癌组织表达上调，且具有正相关性，三者对病变的形成和进展意义明显，联合检测三者的表达量对判断预后可能有一定价值。