黄芩苷镁盐对CCl4诱导的SD大鼠急性肝损伤的影响

郭亚春 李卫 黄群 白冰 宋鸿儒 刘翠哲

(1承德医学院，河北 承德 067000；2承德监狱医院；3河北北方学院)

四氯化碳(CCl4)是一种对肝细胞有严重毒性作用的化学物质。诱导肝损伤的主要机制与激活机体氧化应激反应有关〔1〕。CCl4肝损伤模型所表现的肝细胞损伤、坏死、纤维化等，与一些临床常见的酒精肝损伤、病毒肝损伤等类似〔2〕。因此，CCl4诱导肝损伤模型是目前常用的肝损伤模型之一。黄芩苷是从中药黄芩中提取出的一种具有清除自由基、抗氧化、抗炎等多种药理作用的黄酮类化合物。黄芩苷可以通过抗氧化活性对CCl4诱导肝损伤产生保护作用〔3〕，但其水溶性极差，限制了其临床应用。黄芩苷镁盐为黄芩苷在中药黄芩中的原本存在形式，其水溶性极好〔4〕。本研究通过建立CCl4诱导SD大鼠急性肝损伤模型，尾静脉注射不同浓度的黄芩苷镁盐，探讨黄芩苷镁盐对CCl4诱导大鼠急性肝损伤的保护作用及有效的药物治疗浓度。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级雄性SD大鼠80只，实验起始体重150～170 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司；所有动物于清洁级动物室饲养，自由饮食，定时换气，室内温度(22±2)℃，室内湿度为70%，每日光照10 h。

1.2药物 黄芩苷镁盐(承德医学院中药研究所刘翠哲教授课题组提供，纯度93.1%)；CCl4(购于国药集团化学试剂有限公司)；异甘草酸镁注射液(购于正大天晴药业集团股份有限公司)。

1.3实验仪器与试剂 二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(美国thermo公司)；丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。721N可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；Leica RM2235石蜡切片机(德国Leica仪器公司)；酶标仪(加拿大Biotek公司)。

1.4实验方法

1.4.1动物分组与造模 实验分为正常对照组、模型组、阳性对照组〔异甘草酸镁，18 mg/(kg·d)〕及黄芩苷镁盐Ⅰ〔12.5 mg(kg·d)〕、Ⅱ〔25.0 mg/(kg·d)〕、Ⅲ〔50.0 mg/(kg·d)〕、Ⅳ〔100.0 mg/(kg·d)〕、Ⅴ〔200.0 mg/(kg·d)〕组，每组10只，尾静脉连续给药1 w。正常对照组与模型组每天尾静脉注射等体积的无菌生理盐水。末次给药2 h后，除正常对照组腹腔注射等体积的橄榄油外，其余各组按1 ml/kg腹腔注射50%的CCl4溶液进行模型制备。

1.4.2血生化指标检测 各组大鼠腹主动脉取血，置于冰上，静置1 h，3 000 r/min离心10 min，取血清样本，送承德医学院附属医院检验科用全自动生化分析仪检测血清中ALT、AST活性。

1.4.3肝脏病理组织切片观察 各组大鼠均取肝左大叶的相同部位组织以10%中性甲醛固定24 h，切取约3 mm厚的组织置于全自动脱水机中常规脱水，包埋，行4 μm厚度连续切片，然后常规苏木素-伊红(HE)染色，封片，光镜下检查各组大鼠肝组织损伤情况。

1.4.4肝组织匀浆检测 按南京建成生物工程研究所肝组织匀浆制备说明书制备10%肝组织匀浆，BCA法测定肝组织匀浆蛋白浓度。按MDA测定试剂盒说明，配制标准管、空白管、测定管、对照管，应用硫代巴比妥酸法测定各组大鼠肝组织受自由基攻击的严重程度。

1.5统计学分析 使用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况 整个实验过程中各组大鼠的体重均有所增加，与正常对照组相比，模型组大鼠体重较轻，精神萎靡，反应迟钝，毛色黯淡，毛质粗糙。黄芩苷镁盐各组与异甘草酸镁组大鼠的上述情况均有所改善。

2.2各组大鼠血ALT、AST活性的变化情况 与正常对照组相比，模型组ALT、AST水平显著增高(P<0.01)。与模型组相比，黄芩苷镁盐Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组ALT、AST水平均显著降低(P<0.05)。与阳性对照组相比，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组黄芩苷镁盐ALT水平均显著降低(P<0.05)，黄芩苷镁盐Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组AST水平与阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3肝组织病理学改变 正常对照组大鼠肝细胞结构完整，排列规则，胞质染色均匀，镜下可清晰看到完整的细胞核。模型组肝细胞结构破坏明显，细胞间隙变大，胞质染色不均，胞质间可见明显脂滴，出现明显的气球样变，细胞核出现偏移、固缩。黄芩苷镁盐Ⅰ、Ⅱ组肝细胞间隙的破坏和气球样变较模型组有所改善，黄芩苷镁盐Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组肝细胞结构的破坏有明显改善。阳性对照组较模型组的病理损伤也具有明显改善。见图1。

2.4肝组织匀浆中MDA含量的变化 与正常对照组相比，模型组肝组织MDA水平显著升高(P<0.01)。与模型组相比，阳性对照组与黄芩苷镁盐Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组均显著降低肝组织中MDA水平(P<0.05)。与阳性对照组相比，黄芩苷镁盐Ⅳ、Ⅴ组MDA降低水平差异无统计学意义 (P>0.05)，见表1。

表1 各组ALT、AST 及MDA水平变化情况

与正常组比较:1)P<0.01;与模型组比较:2)P<0.05;3)P<0.01;与阳性组比较:4)P<0.05;5)P<0.01

正常对照组

模型组

阳性对照组

黄芩苷镁盐Ⅳ组

3 讨 论

急性肝损伤是由多种因素共同参与所导致的一种复杂的病理过程。长期肝损伤最终可导致肝硬化、肝癌等疾病的发生。因此，深入研究和探讨急性肝损伤的发病机制及有效治疗措施，对肝脏疾病的防治具有重要意义。CCl4急性肝损伤模型是用于保肝药物筛选的经典模型之一〔5〕。CCl4在体内经肝细胞微粒体中的细胞色素P450 酶系代谢，其代谢产物Cl·和CCl3·可大量消耗机体超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽等抗氧化物，致使机体发生氧化应激〔6〕，从而引起肝微粒体及肝细胞膜发生脂质过氧化等一系列的连锁反应，致使肝细胞膜被破坏，导致肝细胞的变性及坏死〔6,7〕。

ALT和AST主要存在于肝细胞胞质中，当肝细胞膜破裂时，血清中的ALT及AST水平将明显升高，因此，ALT和AST是反映肝细胞损伤的重要指标。MDA是组织细胞生物膜发生脂质过氧化反应后的产物，肝组织中的MDA 水平不仅可以反映肝脏细胞生物膜的脂质过氧化水平，还可以反映肝脏疾病严重程度〔8〕。因此本研究将大鼠血清中ALT、AST及肝组织中MDA水平作为反映肝损伤的指标。研究显示CCl4造模后大鼠血清中ALT、AST及肝组织中MDA水平较正常对照组显著升高，提示急性肝损伤大鼠模型制备成功。应用不同浓度的黄芩苷镁盐尾静脉注射预防后，大鼠血清ALT、AST水平下降，并随黄芩苷镁盐剂量的升高，ALT、AST的下降水平愈加显著，尤其以50.0 mg/kg、100.0 mg/kg、200.0 mg/kg黄芩苷镁盐效果显著，说明黄芩苷镁盐具有降低转氨酶的作用，而这种作用与其药物浓度有关，具有一定的剂量依赖性。检测肝组织MDA水平发现黄芩苷镁盐尾静脉注射预防后，黄芩苷镁盐可以降低MDA水平，也以50.0 mg/kg、100.0 mg/kg、200.0 mg/kg黄芩苷镁盐效果显著，说明黄芩苷镁盐可以通过拮抗肝脏细胞生物膜的脂质过氧化水平，进而保护肝脏细胞，其效果也与其药物浓度有关，具有一定的剂量依赖性。肝组织病理学检查显示，应用黄芩苷镁盐预防后，肝细胞结构的破坏有明显改善，气球样变明显减轻，其检查结果与血清肝功能及肝组织的MDA检查结果相一致。以上研究结果综合说明黄芩苷镁盐对CCl4急性肝损伤大鼠具有良好的预防保护作用，并且黄芩苷镁盐对CCl4急性肝损伤大鼠的保护作用具有一定的剂量依赖性。

异甘草酸镁是肝细胞的一种保护剂，能够抗炎、改善肝功能、保护肝细胞膜。研究表明异甘草酸镁对D-氨基半乳糖引起的急性肝损伤具有防治作用，能减轻肝细胞坏死、炎细胞浸润，其机制可能与异甘草酸镁抑制脂质过氧化反应，保护机体抗氧化酶活性，提高肝细胞膜系统的稳定性有关〔9〕。异甘草酸镁对CCl4诱导的慢性肝损伤具有治疗效果，可以改善肝功能，减轻纤维化程度，其机制可能与异甘草酸镁下调脯氨酰羟化酶的活性，减少胶原合成；降低一氧化氮(NO)水平，抑制CCl4引起的氧化性肝损伤有关〔10〕。异甘草酸镁对于免疫性肝损伤也具有一定的保护作用，因此本研究选用异甘草酸镁作为阳性对照药物。研究结果显示，50.0 mg/kg、100.0 mg/kg、200.0 mg/kg黄芩苷镁盐对ALT的降低作用明显优于异甘草酸镁组，而对于AST的降低作用12.5 mg/kg、25.0 mg/kg的黄芩苷镁盐不及异甘草酸镁，50.0 mg/kg、100.0 mg/kg、200.0 mg/kg黄芩苷镁盐与异甘草酸镁无明显区别。检测MDA水平发现，12.5 mg/kg、25.0 mg/kg、50.0 mg/kg的黄芩苷镁盐不及异甘草酸镁降低明显，结合病理学检查结果，只有黄芩苷镁盐达到100.0 mg/kg，其对CCl4诱导的急性肝损伤保护作用才可与异甘草酸镁相一致。因此，黄芩苷镁盐100.0 mg/(kg·d)可以作为治疗CCl4诱导的急性肝损伤用药剂量。