红景天苷促进小鼠脊髓损伤后巨噬细胞表型转变及神经功能修复

卢桃利 霍芳芳 翟中杰 张蓓

(1成都市第二人民医院神经内科，四川 成都 610015；空军军医大学 2第一附属医院神经内科；3卫生统计学教研室)

脊髓损伤(SCI)分为原发性损伤和继发性损伤〔1〕。研究证实继发性损伤能诱导出血、水肿、凋亡及炎症反应，其中炎症反应尤为重要，直接影响SCI后神经功能的恢复〔2〕。巨噬/小胶质细胞因其特殊表型，直接影响炎症反应过程，具体分型为：促炎(M1)表型即经典激活型和抑炎(M2)表型，被称为选择激活表型〔3,4〕。M1表型细胞在脂多糖(LPS)或干扰素(INF)-γ的诱导下释放多种促炎因子，加重炎症反应〔5〕；M2表型细胞可能在抑炎因子白细胞介素(IL)-4，IL-13的作用下上调抑炎因子〔6〕。因此，促进M1向M2转换，减轻SCI后的炎症反应，减少轴突损害，促进脊髓功能恢复意义重大〔7〕。红景天苷是从红景天中提取出来的一种糖氧苷类化合物，具有保护心肌和抗心律失常作用〔8〕，在抗衰老〔9〕、肿瘤〔10〕及中枢神经系统疾病亦有重要作用〔11,12〕。在炎症反应方面，红景天苷可通过分泌抑炎因子抑制LPS诱导的炎症反应，同时通过丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路表达促炎因子〔13〕。红景天苷可能改善巨噬/小胶质细胞极性，发挥神经保护作用〔14〕，但具体机制仍不清楚。本研究通过脊髓钳夹法建立小鼠SCI模型，探讨红景天苷对SCI局部炎症微环境尤其是巨噬/小胶质细胞表型的影响。

1 材料和方法

1.1实验动物及分组 90只8周龄雌性C57BL/6小鼠，SPF级，体质量15～20 g。空军军医大学实验动物中心提供〔动物合格证号SCXK(军)2012-0007〕。实验分组：SCI组(对照组)和SCI+红景天苷治疗组(红景天苷组)，将两组分为损伤后1、3、7、14和28 d 5个亚组，进行相关检测。

1.2实验试剂 红景天苷(美国Sigma 公司)；SYBR Green实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)定量试剂盒(日本Takara公司)；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国R&D 公司)；免疫荧光一抗抗体：抗-Arginase(Arg)1、抗-诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及抗-黏附分子CD11b抗体(美国Abcam公司)；荧光二抗抗体：驴抗兔488，驴抗羊555和驴抗大鼠594(美国Invitrogen 公司)。

1.3动物处理及实验方法 暴露小鼠 T9-T11脊柱，使用椎板切除术咬除 T10 节段，用动脉夹置于T10两侧并持续 30 s，达到有效破坏小鼠皮质脊髓束，缝合肌肉层和皮肤。红景天苷组于术后开始给予红景天苷(20 μg/g)，1次/d，直至处死。对照组同一时间给予生理盐水。术后适时压迫膀胱帮助排尿。

1.4观察及指标检测

1.4.1行为学评分 采用双盲法对两组实验小鼠在SCI模型制作前及损伤后1、3、7、14和28 d进行神经功能评分(BNS)。具体标准主要从行走步态、肢体承重及关节活动方面进行评估。

1.4.2免疫荧光染色分析M1和M2细胞 取损伤组织标本行冰冻切片包埋剂(OCT)包埋，制作冰冻切片(n=4)，经0.3%Triton破膜及5%牛血清蛋白(BSA)封闭处理后，使用荧光一抗抗体鼠抗-iNOS(1∶100;M1 Marker)与免抗-黏附分子CD11b(1∶200;巨噬/小胶质细胞Marker)结合，放置 4℃冰箱过夜；磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后与荧光二抗(1∶1 000)结合行Alex-flour 标记，室温孵育，漂洗后4′6-二脒基-二苯基吲哚(DAPI)封片；同样方法使用荧光一抗羊抗-Arg-1(1∶100;M2 Marker)，标记M2表型细胞。最后激光共聚焦荧光显微镜照片及采图。计数iNOS/CD11b标记的M1表型细胞数及Arg1+/CD11b标记的M2表型细胞数。

1.4.3RT-PCR检测M1和M2 表型表达 各时间点分别取损伤中心组织，通过Trizol法提取总RNA，检测RNA浓度后转录为cDNA可进行RT-PCR反应。引物设计：iNOS引物：上游：CCCTTCAATGGTTGGTACATGG，下游：ACATTGATCTCCGTGAC-AG CC;CD86引物：上游：TTTGGACACCCAGATGTTTCAG，下游：GTCTTCCTTGAGCACCTGGATC;Arg1引物：上游CAGAAGAATGGAAGAGTCAG，下游：CAGATATGCAGGGAGTCACC；几丁质酶蛋白3(Ym1)：引物上游：TGGAGGATGGAAGTTTGGAC,下游：AATGATTCCTGCTCCTGTGG。PCR循环条件：95℃ 30 s，75℃60 s，60℃30 s，40个循环；95℃ 15 s后4℃保存。

1.4.4ELISA法检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6、IL-1β、IL-10蛋白表达 各时间点取损伤中心组织，匀浆充分，离心，收集上清，-80℃冷藏备用。按说明书操作，测量各孔的吸光度(OD值)。

1.5统计学分析 采用SPSS20.0统计软件进行两因素方差分析、重复测量方差分析。

2 结 果

2.1BNS SCI后两组各时间点均出现神经功能缺损。随着时间推移两组神经功能有所恢复，但红景天苷组在3、7、14、28 d BNS评分明显高于对照组(P<0.01)。见表1。

2.2免疫荧光标记法 与对照组相比，术后3、7、14 d时红景天苷组M1表型细胞(iNOS/CD11b)的比例显著降低(P<0.01)，M2表型细胞(Arg1/CD11b)的比例显著提高，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表2。

2.3RT-PCR检测结果 红景天苷组术后1、3、7 d的M1表型细胞iNOS和术后3、7、14 d CD86 mRNA的表达较对照组显著减少，而术后1、3、7 d M2表型细胞Arg1、YM-1 mRNA的表达较对照组显著增加(P<0.05，P<0.01)，见图1、表3、表4，图2。

表1 SCI后两组各时间点BNS评分比较分,n=15)

与对照组比较：1)P<0.01；表2同

表2 两组各时间点M1表型(iNOS/CD11b)、M2表型(Arg1/CD11b)巨噬细胞比例

图1 SCI后第7天两组损伤节段M1表型巨噬细胞免疫荧光染色(标尺=200 μm)

组别iNOS mRNA术后1 d 术后 3 d术后7 d术后14 dCD86 mRNA术后1 d 术后3 d术后7 d 术后14 d对照组7.34±1.8712.45±1.217.57±1.59 2.06±1.171.73±0.62 4.73±0.50 12.02±2.20 7.00±1.20红景天苷组3.72±1.091)5.36±1.002)2.40±0.612)1.37±0.471.08±0.28 2.24±0.781)3.64±0.832)1.89±0.372)

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

表4 两组各时间点M2表型(Arg1、YM-1)巨噬细胞mRNA表达

图2 SCI后第7天两组损伤节段M2表型巨噬细胞免疫荧光染色(标尺=200 μm)

2.4两组炎症因子的表达 与对照组比较，红景天苷组抑制促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达(P<0.05,P<0.01)，在损伤后7 d尤为明显；同时促进抑炎因子IL-10的表达(P<0.05,P<0.01)。见表5。

表5 两组各时间点局部促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10表达水平

3 讨 论

SCI后对机体运动和感觉造成极大损伤，给社会和家庭带来负担。如何减轻缓解SCI后的炎症及神经功能缺损尤为重要。继发性SCI后早期M1巨噬细胞较M2巨噬细胞比例高，释放促炎因子，加重炎症反应；M2能够促进抑炎因子的释放，诱导Th1向Th2的分化，同时这些抑炎因子也能进一步促进局部巨噬细胞向M2分化〔15,16〕。SCI后局部给予脑源性神经营养因子(BDNF)能上调IL-10和IL-13，下调IL-1β和,TNF-α,促进M1向M2表型转变，在SCI后神经功能恢复发挥重要作用〔17〕。SCI后M1巨噬细胞炎性反应迅速且持久，而M2巨噬细胞的保护作用缓慢又短暂〔18〕，如何维持M1∶M2比例水平，促进SCI后的神经功能恢复，将是目前基础与临床研究的热点。

红景天苷在SCI后凋亡等系列反应中发挥作用，是否参与SCI巨噬细胞极性目前报道较少。Liu等〔14〕试验证实红景天苷能促进脑缺血后小鼠体内M2巨噬细胞极性表达，可能与红景天苷下调小胶质瘤细胞(BV2细胞)，抑制M1小胶质细胞分泌炎症因子有关。而小胶质细胞主要参与SCI后的炎症反应。Wang等〔19〕的体外实验报道红景天苷能抑制M1小胶质细胞极性表达，上调M2小胶质细胞表型Arg1的表达，表明红景天苷通过调节M1和M2细胞表达比例参与炎症反应。本实验发现，红景天苷下调SCI后损伤局部iNOS/CD86/CD11b(M1表型细胞)表达，促进Arg1/YM-1/CD11b(M2表型细胞)的表达，说明红景天苷参与SCI后小胶质/巨噬细胞极性向M2分化。

既往实验显示，SCI后M1小胶质/巨噬细胞分泌促炎因子，M2小胶质/巨噬细胞释放抑炎因子，而炎症因子在参与炎症级联反应的同时反过来影响巨噬小胶质极性分化〔6,20〕。其中促炎因子尤其是TNF-α、IL-6和IL-1β发挥神经毒性作用。因此抑制M1小胶质/巨噬细胞极性，能抑制炎症因子释放，可能发挥神经保护作用。本实验也发现红景天苷能抑制促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β表达，上调抑炎因子IL-10的表达，与红景天苷抑制M1巨噬/小胶质细胞极性，促进向M2小胶质/巨噬细胞分化有关。且本实验还发现SCI早期，抑炎因子占优势，在SCI 3 d、7 d红景天苷主要以抑制炎性因子表达为主要表现，在损伤后期14 d甚至更长时间，红景天苷主要促进抑炎因子的表达，推测红景天苷可能在SCI早期以抑制M1巨噬细胞参与的炎症反应为主，而后期通过上调抑炎因子延长发挥M2巨噬细胞的神经修复作用，具体机制仍需进一步研究。

炎症反应在SCI后神经功能恢复中发挥重要作用。使用IL-6单克隆抗体抑制SCI后IL-6的过表达，能降低iNOS、CD26/32阳性细胞表达，促进M2表型因子Arg1及CD206的表达，证明抑制炎症因子IL-6有利于向M2巨噬细胞表型转变，降低炎症反应，促进SCI后功能恢复〔21〕。红景天苷在多种神经系统疾病中发挥神经保护作用，推测可能与红景天苷参与炎症反应有关。红景天苷能下调促炎因子表达，促进M1巨噬细胞向M2巨噬细胞转变，减少局灶脑缺血后的梗死面积及改善运动功能恢复〔14〕。本实验也发现红景天苷能促进SCI后运动功能恢复，可能与红景天苷促进巨噬细胞极性有关，这与Wang等〔19〕试验一致。除此之外红景天苷还能促进髓鞘再生，抑制自体吞噬〔22〕、凋亡〔23〕及氧化应激〔24〕等，发挥神经保护作用。

综上，红景天苷可能通过影响巨噬细胞极性改变，抑制炎症反应，改善SCI后神经功能。巨噬细胞极性转化涉及多因子、多通路，具体机制仍需进一步研究。