补肝益肾通络法对佐剂型关节炎大鼠Th17/Treg平衡的影响*

郭德强 张春芳 周亚滨 张万里 赵丽华 马晓雪

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨 150040）

类风湿关节炎（RA）为难以治愈的自身免疫疾病，临床以滑膜炎、血管翳为基本病理表现，具有对称性和致残率高的特性，其临床表现主要为累及关节滑膜的炎症、晨起僵硬、日久导致软骨及骨组织的侵蚀和关节结构的破坏等［1-2］，如不及早治疗，日久后会引起关节变形，以致工作能力的丧失。自拟汤是基于先前研究［3-5］，在三痹汤的基础上化裁而来，本实验以佐剂型关节炎大鼠为实验对象，观察补肝益肾通络法对Th17/Treg平衡的影响。

在RA的现在研究中对于其发病机制尚未明确，但免疫紊乱仍然其发病的主要原因，一般都认为和T细胞有关，最近研究表明［6］，Th17细胞在RA发生发展过程中起着主要作用，而Treg细胞在抑制炎症反应的地位尤为突出。Th17细胞通过产生促炎性细胞因子白细胞介素-17（IL-17）促进骨滑膜炎性的产生，以致骨和关节的损伤［7-8］，Treg细胞通过发挥抑制炎性反应作用，降低炎性因子的产生而发挥其免疫应答过程［9］。根据近年来研究报道RA患者的各种病因导致Th17细胞增多，同时造成与之对抗的Treg细胞减少，以至于造成Th17/Treg平衡失调，最终会导致其发生炎性反应、关节遭受破坏和骨侵蚀［10］。因此Th17/Treg平衡在RA发生发展过程中起着重要作用，因此纠正Th17/Treg平衡有着重要意义。本研究围绕着补肝益肾通络法对佐剂型关节炎模型大鼠脾脏中的Th17/Treg平衡的影响进行观察，为临床治疗RA提供可靠的实验依据。现报告如下

1 材料与方法

1.1 实验动物 于黑龙江中医药大学的实验动物基地采购雌性Wistar大鼠40只，选择5～7周龄，体质量（180±10） g，大鼠许可证号：SCXK（黑）2013-001。 大鼠喂养于独立的动物实验室内。保持通风恒温恒湿环境，喂养中善待动物，符合动物的伦理要求。

1.2 试药与仪器 在前期研究基础上选用三痹汤加减（杜仲、川续断、人参、白芍、白茯苓、当归、甘草、杜仲、防风、肉桂、黄芪、牛膝各30 g，独活、川芎、鸡血藤各15 g）。15味中药均购于哈尔滨市药材公司，所有的中药材用3倍剂量的水浸泡1 h后，煎2次，第1次煎3 h，第2次煎2 h。两次煎药液混合后煎煮浓缩。雷公藤汤液的制备：将雷公藤中药切碎，用3倍剂量的水浸泡1 h后，煎煮方法同上，浓缩为大鼠1 d的剂量。弗式完全佐剂（FCA，美国 Sigma公司，批号 1001655385），离子霉素、佛波醇乙酯、蛋白质转运抑制剂莫能菌素（美国Sigma公司），EDTA脱钙液 （美国Biotpped公司）。足容量测量仪（自制），用于观察滑膜组织的光学显微镜购自日本的Olympus公司，批准文号CX23。测定Th17、Treg细胞的流式细胞仪器购自美国Bio-rad公司，批准文号 20142400183，-80 ℃冰箱（905-ults，赛墨飞世尔科技有限公司），CO2的细胞培养箱 （美国New Brunswick公司，型号 Galaxy170R）。

1.3 分组与造模 采购的大鼠选择标准的随机数字表法来分为空白组、模型对照组、自拟汤组、雷公藤组，每组取10只，实验过程中，分笼饲养，每个笼子里5只大鼠，自然光照，并定期清洁、消毒。除空白组大鼠外余组制作模型，从冰箱取出FCA，充分摇匀后，将所有大鼠进行消毒，消毒后将大鼠后肢拉直，选用1 mL注射器、对准右后足跖的中部，皮下注射0.1 mL FCA。3组均制备佐剂型关节炎大鼠模型，模型成功建立的标准按照关节炎评分指数标准，3组大鼠造模成功。

1.4 给药方法 按照人和大鼠给药剂量的体表面积换算公式计算出用药剂量，于造模后的第9天开始灌胃给药，自拟汤中给予质量浓度1.85 g/mL，2 mL/d灌胃。与此同时，空白组、模型对照组给予同等剂量的0.9%氯化钠注射液喂服，连续喂服3周。

1.5 标本采集与检测 1） 分别于0、1、2、3、4周时使用自制的足容积测量仪来测量每个组的大鼠足容积，以每组大鼠的足容积变化来作为足肿胀度观察指标。2）造模后21 d后处死每组大鼠，用刀片从双膝关节剥离出完整的滑膜组织，用4%的多聚甲醛将其固定2 h，用10%的EDTA脱钙1周，梯度酒精脱水，HE常规染色，于光学显微镜下来观察处理后的关节滑膜的病理变化。3）流式细胞分析检测Th17、Treg细胞的表达：取大鼠脾脏淋巴细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL，接种24孔板，与离子霉素、佛波醇乙酯、蛋白质转运抑制剂莫能菌素混合于恒温的5%CO2的细胞培养箱中培养 4 h，收集细胞，重悬与 100 μL的 PBS，收集细胞，洗液洗2次，加入IgG抗体，封闭FcR，进行表面标志染色，之后加入荧光标记的IL17抗体，选用流式细胞仪进行检测分析，对于Treg细胞的检测，直接进行胞内染色进行，方法同上。Th17细胞和Treg细胞的测定由黑龙江中医药大学分子实验室协助完成。

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，选用单因素方差分析来进行多组间比较，多组间两两比较选用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 自拟汤对大鼠足量的影响 见表1。与空白组比较，造模后的模型组、自拟方剂量组大鼠足容积于第1周、第2周、第 3周、第 4周明显增大（P＜0.05），提示AA大鼠模型制备成功。与模型对照组比较，自拟汤组和雷公藤组的大鼠足容积于第2、3周明显减小 （P＜0.05）。

2.2 自拟汤对AA大鼠病变关节及关节周围软组织的影响 见图1。关节和滑膜的病理变化：空白组大鼠剥离的关节滑膜组织细胞排列规则，表面光滑且无炎性细胞浸润，无关节软骨、骨结构的破坏。模型对照组大鼠通过光镜来观察其滑膜组织，观察到滑膜增生，伴有充血、水肿，细胞排列无序，滑膜衬底细胞间隙增大，伴有小血管增生，大量纤维沉积，关节表面粗糙。自拟汤组增生程度减轻，炎性反应减弱，散在的炎性细胞如中性粒细胞、单核细胞的浸润，光镜下可见少量的小血管增生。雷公藤组于光镜下见轻度的滑膜增生伴有散在的浸润的炎性细胞，未见明显增生，光镜下见少量的小血管增生。

表1 自拟汤对大鼠足容积的影响（mL，±s）

表1 自拟汤对大鼠足容积的影响（mL，±s）

与空白组同时间比较，△P＜0.05；与模型组同时间比较，*P＜0.05；与自拟汤组同时间比较，#P＜0.05。

第3周 第4周1.62±0.017 1.68±0.011 1.61±0.015 1.69±0.015 2.81±0.013△ 2.80±0.014△（n＝10） 左 1.49±0.015 1.63±0.013△ 2.11±0.011△ 2.19±0.014△ 2.25±0.012△自拟汤组 右 1.51±0.012 1.73±0.015△ 2.43±0.015△*2.38±0.011△*2.01±0.011△*（n＝10） 左 1.49±0.011 1.62±0.012△ 2.12±0.013△*2.04±0.014△*1.98±0.017△*雷公藤组 右 1.51±0.011 1.74±0.011△ 2.43±0.017△*2.36±0.014△*#2.03±0.014△*#（n＝10） 左 1.49±0.016 1.62±0.014△ 2.10±0.015△*2.05±0.012△*1.97±0.012△*组 别空白组 右（n＝10） 左模型组 右第0周 第1周 第2周1.51±0.014 1.53±0.014 1.56±0.013 1.49±0.013 1.53±0.015 1.55±0.012 1.50±0.014 1.74±0.012△ 2.41±0.016△

2.3 自拟汤对大鼠Th17和Treg细胞的影响 见表2。其余3组与空白组比较，Th17细胞数量比率明显升高，Treg细胞的数量比率明显降低（均P＜0.05），与模型组比较，自拟汤组和雷公藤组Th17细胞的数量比率明显降低 （P＜0.05），Treg细胞的比率有所上升 （P＞0.05）；自拟汤组与雷公藤组比较，Th17细胞数量变化与Treg细胞相比其比率无统计学意义（P＞0.05）。

表2 自拟汤对大鼠Th17和Treg细胞的影响（%，±s）

表2 自拟汤对大鼠Th17和Treg细胞的影响（%，±s）

组 别 n Th17细胞 Treg细胞空白组 10 1.21±0.55△ 11.09±1.15模型组 10 2.34±0.23△ 8.25±0.67△自拟汤组 10 1.67±0.33*△ 10.21±0.37△雷公藤组 10 1.62±0.61*△ 10.52±0.21△

3 讨 论

RA在发生发展过程中因免疫细胞活化的参与以及数种细胞因子而呈进行性发展。研究发现，Th17细胞通过产生促炎性细胞因子白细胞介素-17促进骨滑膜炎性的产生，以致骨和关节的损伤［11］，而Treg细胞通过产生一些白细胞介素-10和转化生长因子-β等抑制性细胞因子来调节RA中免疫应答过程［12］。Th17细胞和Treg细胞分化过程既有共同之处又相互对抗，影响着RA的发生和转归。近几年研究表明，雷公藤在调节Th17/Treg平衡有着突出的效果［13-14］。在先前研究的基础上，发现运用补肝肾，益气血，通经络的方法，能减轻关节滑膜的炎细胞浸润，但对Th17/Treg的影响尚不清楚。本研究运用补肝肾、益气血、通经络的方法对造模大鼠的治疗，通过用流式细胞术对Th17和Treg细胞数量的观察，发现补肝肾、益气血、通经络的方法对Th17/Treg的平衡具有调节作用。

本研究采用AA大鼠模型，观察运用补肝肾、益气血、通经络的方法对大鼠体内Th17和Treg细胞的影响。根据研究结果表明，与空白组对比，其余3组在造模后均有炎症反应，自拟汤组和雷公藤组与模型组比较，造模大鼠经自拟汤组与雷公藤组治疗后，关节滑膜炎性浸润受到抑制，延缓关节软骨与周围组织的破坏。AA大鼠模型的比率明显升高，Treg细胞的比率明显降低，自拟汤组和雷公藤组对于降低Th17细胞比率具有明显作用，在一定程度上促进了Treg细胞的表达。

RA属于中医学“痹证”的范畴，其有多种别称，亦有将其称为历节、白虎历节等病名者。明·龚廷贤《寿世保元》云“疼痛不仁，两尺脉来沉细者，此痹症也。内经曰，寒气胜者为痛痹……今疼痛不仁，是寒而且着也”。本病乃由机体痹着风寒湿邪日久，以致肝肾不足，经络痹阻，气血亏虚所致。如《证治汇补·痹症》云“由元精内虚，而三气所袭……流注经络，久而成痹”［15］。自拟方由三痹汤加减而成，在先前研究中［16-17］，三痹汤在调控致炎因子水平具有良好的效果。三痹汤源于《妇人良方》卷三，具有补气血、益肝肾、通经络的作用，方中选用四君子汤和四物汤共奏补气血之功效，方中杜仲、续断、牛膝有补益肝肾作用，当归、川芎、秦艽、独活活血以通经络。实验研究表明，补肝益肾通络法能降低Th17的含量，调和关节炎性反应，具有突出的临床意义。