羟乙基淀粉40氯化钠注射液中细菌内毒素的检查方法

王 瑶 ，刘 洋 ，胡 晨 ，孟长虹 ，史清水 *1南京医科大学公共卫生学院，南京 11166；江苏省食品药品监督检验研究院，南京 1009

羟乙基淀粉为基药新增品种，血容量补充药，主要用于预防和治疗各种原因造成的低血容量，包括失血性、烧伤性及手术中休克，血栓闭塞性疾患等[1]。羟乙基淀粉40注射液现行标准收载于卫生部药品标准二部六册（生化药品第一分册），但现在标准中采用的是热原法。根据《中国药典》2015年版四部通则规定，注射剂都应进行细菌内毒素或热原检查。热原法存在使用家兔、实验要求高、操作繁琐、影响因素多等缺点。细菌内毒素法具有快速灵敏、重现性好、简便易行等优点。为更好地加强药品质量控制，对羟乙基淀粉40氯化钠注射液采用细菌内毒素检查法的可行性进行了研究。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

BET-48G细菌内毒素测定仪和ET-96型细菌内毒素凝胶法测定仪（天津市天大天发科技有限公司）；ZH-2 Blender涡旋混匀器（天津药典标准仪器厂）；Eppenddorf移液枪（规格 250μL、1000μL，德国艾本德公司）。

1.2 药品与试剂

羟乙基淀粉40氯化钠注射液 （批号2A17030306、2A17030307、2A17030308， 山东齐都药业有限公司）；细菌内毒素工作标准品 （规格80 EU/支，批号150601-201784，中国食品药品检定研究院）；鲎试剂（规格 0.1 mL，灵敏度 0.5 EU·mL-1，批号1705102，湛江安度斯生物有限公司）；鲎试剂（规格 0.1 mL，灵敏度 0.5 EU·mL-1，批号 1707250，湛江博康海洋生物有限公司）；动态浊度法鲎试剂（规格1.25 mL/支，批号 1701222，检测范围 10～0.03 EU·mL-1，湛江安度斯生物有限公司）；细菌内毒素检查用水（BET 水，规格 5 mL/支，批号 160006-201784，中国食品药品检定研究院）。

2 方法与结果[2]

2.1 供试品细菌内毒素限值（L）

按《中国药典》2015年版四部通则，细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：

式中L表示供试品的细菌内毒素限值；K表示人每千克体重每小时最大可接受的内毒素的量，以EU·kg-1·h-1表示，其中注射剂K值为5EU·kg-1·h-1；M为人用每kg体重每小时的最大供试品剂量。

羟乙基淀粉40氯化钠注射液每小时最大用量500mL，人体重按 60kg 计算，得 M=8.33mL·kg-1·h-1，L=0.6 EU·mL-1。考虑到临床的联合用药，所以将本品的细菌内毒素限值定为0.5 EU·mL-1。

2.2 凝胶限度试验[3]

2.2.1 鲎试剂灵敏度复核 将细菌内毒素工作标准品用1mL BET水溶解，在涡旋混匀器上混匀15min，然后稀释成 2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ（鲎试剂灵敏度标示值λ为0.5 EU·mL-1）4个浓度，另加2管BET水作阳性对照（NC）。分别取两个厂家鲎试剂按《中国药典》2015年版四部通则“细菌内毒素检查法”进行灵敏度复核试验，结果见表1。

2.2.2 干扰预实验 羟乙基淀粉40氯化钠注射液最小有效稀释浓度记为MVC，c=λ/L（L为本品细菌内毒素限值0.5 EU·mL-1，λ为鲎试剂标识灵敏度）。目前市售鲎试剂 λ 一般为 0.5、0.25、0.125、0.06、0.03EU·mL-1，则对应的供试品 MVC 为原液、2 倍、4倍、8倍和16倍稀释液。将羟乙基淀粉40氯化钠注射液分别用BET水稀释成原液、2倍、4倍、8倍和16倍稀释液，将此系列溶液记为NPC，同时在上述试验液中加入细菌内毒素标准溶液，使每一浓度的试验液中均含有2λ浓度的细菌内毒素，记此系列溶液为PPC。

取灵敏度为0.5 EU·mL-1的两个不同厂家的鲎试剂，分别与上述NPC和PPC进行反应，每一浓度重复两管，并设阴性对照（NC）和阳性对照（PC）。然后按《中国药典》2015年版四部通则“细菌内毒素检查法”操作，结果见表2。

表2 羟乙基淀粉40氯化钠注射液干扰试验预试验

由表2结果表明，羟乙基淀粉40氯化钠注射液对鲎试剂与细菌内毒素的反应无明显干扰抑制作用。因此，正式干扰试验的浓度选择为原液。

2.2.3 正式干扰试验 为了最终确认是否存在抑制因素的影响，进行以下正式干扰试验。取羟乙基淀粉40氯化钠注射液原液，取灵敏度为0.5EU·mL-1的鲎试剂，按《中国药典》2015年版四部通则中的供试品干扰试验项进行实验，结果见表3。

表3 羟乙基淀粉40氯化钠注射液的干扰试验

由表3结果表明，NC都为阴性，Es（检查用水的反应终点浓度的几何平均值）和Et（供试品溶液的反应终点浓度的几何平均值）在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）范围之内，试验有效。并且供试品在原液浓度下，对鲎试剂与细菌内毒素的反应均无明显干扰抑制作用。

2.2.4 供试品细菌内毒素检查 按 《中国药典》2015年版四部通则“细菌内毒素检查法”，用灵敏度为0.5 EU·mL-1的鲎试剂对供试品进行细菌内毒素检查。取羟乙基淀粉40氯化钠注射液原液（NPC），并同时设立供试品阳性对照管 （PPC）、NC管和PC管，结果见表4。

表4 羟乙基淀粉40氯化钠注射液的细菌内毒素检查结果

由表4结果表明，羟乙基淀粉40氯化钠注射液经 2 个厂家的鲎试剂（λ=0.5 EU·mL-1）测试，结果均符合规定。

2.3 动态浊度法[4，5]

2.3.1 建立细菌内毒标准曲线 将3支定量鲎试剂每支中各加入1.25 mL BET水复溶，并在无热原空安瓿中分别加入0.1 mL复溶的鲎试剂；将细菌内毒素工作标准品用BET水进行稀释，制成含细菌内毒素浓度为 0.125、0.5、2.0 EU·mL-1的溶液， 再取这3个浓度的内毒素溶液0.2 mL分别加入到含有0.1 mL鲎试剂的反应试管中，充分混匀，插入BET-48G型细菌内毒素检测仪内，同时做阴性管。当阴性对照的反应时间大于标准曲线最低点的反应时间时，结束反应。将全部数据进行线性回归分析，得回归方程为：lg t=2.860+（-0.272 lg c），r=-0.998（绝对值应不小于0.980），平行管之间的RSD均小于10%。式中 c为内毒素浓度（EU·mL-1），t为平均反应时间（s），结果见表 5。

表5 细菌内毒素标准曲线及可靠性分析（n=2）

2.3.2 确定供试品最大稀释倍数 取本品原液，L为 0.50 EU·mL-1，标准曲线最低浓度（λc）为 0.031 25 EU·mL-1，供试品的最大有效稀释倍数MVD=cL/λ=16。

2.3.3 供试品干扰试验 将供试品用细菌内毒素检查用水依次稀释为 0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 EU·mL-1的溶液，记为s液；同时在上述试验液中加入细菌内毒素标准溶液，使每一浓度的试验液中均含有λm=0.5 EU·mL-1浓度的细菌内毒素，作为供试品添加在内毒素阳性对照管，记为t液。分别取上述各液0.1 mL，加入预先加有0.1 mL定量用鲎试剂的无热原空安瓿中，混匀后立刻插入BET-48G型细菌内毒素检测仪内进行自动检测，其中每一浓度重复2支。按所得线性回归方程计算出s液和t液的浓度 cs和 ct， 再按下式计算回收率 （R），R=（cs-ct）/λm×100%。

2.3.4 干扰验证试验 由表6可知，当供试品稀释2倍及以上时，其回收率为112%～165%，符合《中国药典》2015年版四部通则的要求，则在该试验条件下不存在干扰。

另取两批供试品 （批号为 2A17030307、2A17030308），按干扰试验的方法分别制备2倍浓度的供试品溶液以及使每一浓度的试验液中均含有λm=0.5 EU·mL-1浓度的细菌内毒素，作为供试品添加内毒素阳性对照管，依法检查。结果B液回收率均在50%～200%，符合《中国药典》2015年版四部通则的要求，且平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，供试品符合规定。

表6 干扰试验及供试品细菌内毒素含量测定结果（n=2）

3 讨 论

细菌内毒素检查法有凝胶法（凝胶限度试验和凝胶半定量试验）和光度测定法（浊度法和显色基质法）。该方法因为统一使用鲎试剂，所以成本低，准确率高。使用最多的是凝胶限度试验，该试验仅对内毒素含量是否超过限度值作出判断，无法定量。定量检测法是发展趋势，更能直观地评价药品中细菌内毒素的含量，从而控制药品质量，监控生产过程中的质量。

有文献报道，目前国外对药品的细菌内毒素检查，采用定量方法测定的大于50%[6]。而最常用的定量检测法是动态浊度法，其灵敏度高，操作简单，可根据观察曲线分析是否有干扰，仪器可以直接处理结果，减少二次处理数据错误的发生，更准确地测定内毒素的含量[7，8]。

本实验中研究了用凝胶限度试验和动态浊度法对羟乙基淀粉40氯化钠注射液的细菌内毒素进行测定。凝胶限度试验证明，本品对2个厂家的鲎试剂均无明显干扰作用。动态浊度法通过计算加入内毒素的回收率来判断是否存在干扰，《中国药典》2015年版四部通则规定回收率在50%～200%。本试验供试品稀释2倍及以上，回收率达到要求，认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用，并对3批供试品进行检查，结果均符合规定。

通过以上细菌内毒素检查法之凝胶法试验和动态浊度法试验，可以证实羟乙基淀粉40氯化钠注射液标准中的热原检查法，是可以用细菌内毒素检查法予以替代，但仍需应用更多的样品和试验来证实。