潞党参口服液对免疫抑制小鼠的免疫调节作用

胡天惠，林 超，项媛媛，辜卫红

1淮安市妇幼保健院，淮安 223002；2南京中医药大学 药学院，南京 210023

党参为补脾益气类中药，潞党参属党参中的上品，为山西潞州道地药材[1]，含有大量多糖、蛋白质、苷类、维生素和矿物类成分，是中医临床上常用的中药之一，具有补中益气、健脾益肺、养血生津的作用，主要用于治疗四肢无力、食欲不佳、气津两虚、气血双亏以及血虚萎黄等诸症[2-4]。临床研究发现，潞党参能够增加癌症放疗患者白细胞数量、体液IgM水平、增强免疫功能[5，6]，表明潞党参有增强免疫抑制机体的免疫功能。由潞党参制成的潞党参口服液具有补中益气、健脾益肺、滋补强壮等功效，临床上已广泛用于脾虚型小儿泄泻，妇产科贫血，慢性胃炎，慢性肾炎及放化疗后脾肺气虚等症候，但是其能否增强免疫抑制小鼠的免疫功能未见报道。本研究采用环磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型[7，8]，探讨潞党参口服液对免疫抑制动物的免疫调节作用，为其临床使用和后续研究提供依据。

1 实验材料

1.1 药品和试剂

潞党参口服液（规格10 mL/瓶，批号：1801303，山西正来制药有限公司，潞党参提取物，每毫升相当于生药量1.667 g，使用时采用生理盐水稀释至实验所需浓度）；10%绵羊红细胞 （批号20180618，南京博硕生物科技有限公司）；RMPI1640培养基 （批号1918892，美国 Gibco公司）；脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS，批号 L2880，北京索莱宝科技有限公司）；刀豆蛋白 A （Concanavalin A，ConA，批号C2967，美国sigma公司）；胎牛血清（批号 11H228，依科赛生物科技有限公司）；噻唑蓝 （MTT，批号SP1175，美国sigma公司）；小鼠 IL-2 Elisa试剂盒（批号L0603429）、小鼠IL-4 Elisa试剂盒 （批号L0815439）、小鼠 IFN-γ Elisa试剂盒 （批号L1126357），均为武汉华美生物工程有限公司；其余试剂均为化学纯（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 仪器

BioTek酶标仪 （美国博腾仪器有限公司）；TC3111恒温细胞培养箱 （美国 Thermo公司）；BP211D电子天平（德国Sartorius公司）；Primo Star倒置显微镜（德国ZEISS公司）。

1.3 实验动物

ICR 小鼠 240 只，体重（20~22）g，雌雄各半，由扬州大学比较医学中心提供，生产许可证号SCXK（苏）2017-0007。动物饲养于无特定病原体动物（Specific Pathogen Free，SPF）屏障环境，温度 20 ℃～22℃，相对湿度60%～70%。

2 实验方法

2.1 模型建立、分组及给药

将240只ICR小鼠按照体重随机分6组，分别为：空白组、模型组、香菇多糖阳性药（0.2 g·kg-1）组和潞党参口服液低、中、高组（3.3、6.6、13.2 g·kg-1），每组40只。除空白组外，其余各组均腹腔注射环磷酰胺50 mg·kg-1，每天一次，连续3 d建立免疫缺陷小鼠模型[7，8]。动物造模后 1 d开始给药，连续14 d，空白组和模型组均灌胃给予生理盐水。

2.2 动物体质量和脏器指数的检测

每组取10只小鼠，均于第14天给药后，禁食不禁水12h，称取小鼠的体质量，摘眼球取血分离血清（用于后续血清细胞因子检测），乙醚麻醉后处死小鼠，解剖小鼠分离胸腺和脾脏，小心取出周围多余的结缔组织，吸水纸吸去表面残血，称重并记录。

2.3 小鼠血清中溶血素测定

每组取10只小鼠于造模后第一天腹腔注射2%绵羊红细胞0.2 mL进行免疫，当天开始给药，末次给药24h后小鼠摘眼球取血，室温静置3h，1500r·min-1离心15 min，分离上层血清。用生理盐水将血清稀释100倍。取1 mL稀释好的血清样品至试管中，依次加入5%绵羊红细胞0.5 mL和10%豚鼠血清0.5 mL，37℃培养箱孵育30 min后冰水浴终止反应，取上清液1 mL于10 mL试管中，加入都氏液4 mL；同时另取一试管，加入5%绵羊红细胞悬液0.25mL后加入都氏液4mL，作为绵羊红细胞的半数溶血值[9]。以不加小鼠血清的空白管调零，于540 nm处进行比色检测，测定各管的OD值并计算半数溶血值（HC50）。公式为：

2.4 脾脏淋巴细胞增殖反应

每组取10只小鼠于末次给药后24 h，麻醉处死，置于75%乙醇中浸泡3 min，无菌条件下分离小鼠脾脏，剪碎脾脏并进行研磨，过200目细胞筛，采用RMPI1640培养基进行稀释并离心，以细胞计数板进行计数，调整细胞浓度后加入96孔细胞培养板中，使每孔细胞的数量为5×105个。各组血清设置3个处理方式：空白处理（只加入细胞悬液）；LPS处理 （加入LPS终浓度为10μg·mL-1和细胞悬液）；ConA处理 （加入ConA终浓度为5μg·mL-1和细胞悬液）。每组设置6个复孔。细胞处理后，将培养板置于37℃含5%CO2的培养箱中继续培养68 h。取出培养板，每孔加入MTT溶液20μL继续培养4 h，加入DMSO 100μL混匀后，于490 nm波长处检测各孔的OD值并计算细胞增殖率[10]。设定空白组脾淋巴细胞增殖率为100%，并计算各组小鼠淋巴细胞相对增殖率。

2.5 腹腔巨噬细胞吞噬能力

每组取10只小鼠，乙醚麻醉后固定于解剖盘上，腹腔注射无血清的RPMI1640培养基4 mL，轻轻抚摸小鼠腹部2 min，小心在小鼠腹部剪口，移液器吸出培养液于无菌离心管中，2 000 r·min-1离心15 min，弃去上清液，细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬，以细胞计数板计数，加入96孔培养板中，使得每孔的细胞数量为1×105，培养板置于37℃含5%CO2的培养箱中培养4 h贴壁，加入MTT 20μL，继续培养4 h，每孔加入10%HCL-SDS 100μL，继续培养8 h，于490 nm波长处测定OD值并计算吞噬指数。

2.6 小鼠血清IL-2、IL-4和IFN-γ水平检测

取“2.2”中分离得到的各组小鼠眼球血的血清，按照Elisa试剂盒说明书进行IL-2、IL-4和IFN-γ水平检测。

2.7 统计学方法

实验计量资料采用均数±标准差 （x±s）表示，SPSS19.0统计软件进行单因素方差分析，Student-Newman-Keuls检验进行组间比较。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结 果

3.1 潞党参口服液对免疫抑制小鼠体重及脏器指数的影响

造模后观察到小鼠精神萎靡、毛发稀疏和摄食量减少的现象，表明环磷酰胺能够造成小鼠免疫器官萎缩，免疫能力下降，免疫抑制小鼠模型建立成功。与空白组相比，模型组、香菇多糖组和潞党参口服液组小鼠体重均显著下降（P＜0.05），模型组小鼠脾脏指数和胸腺指数显著下降（P＜0.01）。与模型组相比，潞党参口服液中、高剂量组（6.6、13.2 g·kg-1）小鼠体质量、胸腺指数和脾脏指数均显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结果表明，潞党参口服液能够促进免疫抑制小鼠免疫器官的发育，增强免疫能力。见表1。

表1 潞党参口服液对免疫抑制小鼠体重及脏器指数的影响（±s，n=10）

表1 潞党参口服液对免疫抑制小鼠体重及脏器指数的影响（±s，n=10）

脾脏指数/%空白组 - 34.26±4.89 0.79±0.16 0.18±0.04模型组 - 24.38±2.06## 0.46±0.09## 0.11±0.03##香菇多糖组 0.2 30.61±3.27** 1.33±0.14**0.25±0.05**3.3 26.47±2.73 0.68±0.11* 0.15±0.04 6.6 27.79±3.35* 0.93±0.19**0.19±0.09**13.2 28.66±3.82** 1.16±0.23** 0.22±0.08**注：与空白组相比，##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。组别 剂量/g·kg-1 体重 胸腺指数/%潞党参口服液组（低）（中）（高）

3.2 潞党参口服液对免疫抑制小鼠血清溶血素水平的影响

与空白组相比，模型组血清溶血素水平显著降低（P＜0.01）。血清溶血素水平是评价机体免疫能力的重要指标，结果表明，免疫抑制剂环磷酰胺能够降低血清溶血素水平，对小鼠的免疫能力产生抑制作用。给予香菇多糖和潞党参口服液治疗后，香菇多糖组、潞党参口服液中、高剂量组（6.6、13.2 g·kg-1）小鼠血清溶血素水平显著提高，且高剂量组（13.2 g·kg-1）的血清溶血素水平高于阳性药香菇多糖组，结果提示，潞党参口服液能够增加免疫抑制小鼠的血清溶血素水平，增强免疫功能。见表2。

表2 潞党参口服液对免疫抑制小鼠血清溶血素的影响（±s，n=10）

表2 潞党参口服液对免疫抑制小鼠血清溶血素的影响（±s，n=10）

潞党参口服液组组别 剂量/g·kg-1 血清溶血素（HC50）空白组 - 15.58±3.37模型组 - 8.85±2.16##香菇多糖组 0.2 12.37±3.58**3.3 9.94±2.89 6.6 10.64±3.05**13.2 13.08±3.29**（低）（中）（高）注：与空白组相比，##P＜0.01；与模型组相比，**P＜0.01。

3.3 潞党参口服液对免疫抑制小鼠淋巴细胞增殖的影响

经ConA与LPS分别诱导后，模型组脾T、B淋巴细胞增殖显著降低，与空白组相比差异具有统计学意义。与模型组相比，香菇多糖和潞党参口服液中、高剂量组（6.6、13.2 g·kg-1）ConA 诱导的 T 淋巴细胞增殖显著 （P＜0.01）；LPS诱导的B淋巴细胞的增殖显著（P＜0.01）。见表 3。

3.4 潞党参口服液对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬指数的影响

与空白组相比，模型组腹腔巨噬细胞吞噬指数显著降低；与模型组相比，香菇多糖和潞党参口服液中、高剂量组（6.6、13.2 g·kg-1）腹腔巨噬细胞吞噬指数显著增加（P＜0.05，P＜0.01），提示潞党参口服液能够增强小鼠非特异性免疫吞噬能力。见表4。

表3 潞党参口服液对免疫抑制小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响（±s，n=6）

潞党参口服液组组别 剂量/g·kg-1 T淋巴细胞/% B淋巴细胞/%空白组 - 100.00±11.26 100.00±12.48模型组 - 40.28±7.74## 45.33±8.15##香菇多糖组 0.2 117.48±12.15** 106.27±10.37**3.3 45.19±7.29 59.60±9.62*6.6 75.56±9.36** 78.82±9.92**13.2 92.18±10.26** 94.59±11.47**（低）（中）（高）注：与对照组相比，##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

表4 潞党参口服液对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬指数的影响（±s，n=10）

表4 潞党参口服液对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬指数的影响（±s，n=10）

潞党参口服液组组别 剂量/g·kg-1 巨噬细胞吞噬指数空白组 - 1.51±0.72模型组 - 1.26±0.48##香菇多糖组 0.2 2.36±0.81**3.3 1.41±0.72 6.6 1.92±0.93*13.2 2.29±0.97**（低）（中）（高）注：与对照组相比，##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.5 潞党参口服液对免疫抑制小鼠IL-2、IL-4和IFN-γ的影响

与空白组相比，模型组血清中IL-2、IL-4和IFN-γ均显著下降。经香菇多糖和潞党参口服液治疗后，香菇多糖和潞党参口服液中、高剂量组（6.6、13.2g·kg-1）血清中 IL-2、IL-4 和 IFN-γ 均显著增加（P＜0.01），结果提示，潞党参口服液能够增强免疫抑制小鼠血清中免疫因子的水平，增强免疫作用。见表5。

表5 潞党参口服液对免疫抑制小鼠血清IL-2、IL-4和TNF-α 的影响（±s，n=10）

表5 潞党参口服液对免疫抑制小鼠血清IL-2、IL-4和TNF-α 的影响（±s，n=10）

IFN-γ/pg·L-1空白组 - 150.94±21.84 71.75±11.28 318.27±47.64模型组 - 96.48±17.62##41.42±7.93##209.35±26.49##香菇多糖组 0.2 137.23±19.80**83.69±13.21**330.26±51.74**3.3 105.19±16.74 60.94±12.89*266.49±38.32*6.6 108.37±18.46**74.37±11.28**300.34±47.27**13.2 119.04±20.37**78.65±10.03**328.16±42.93**组别 剂量/g·kg-1 IL-2/pg·L-1 IL-4/pg·L-1潞党参口服液组（低）（中）（高）注：与空白组相比，##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

4 讨 论

环磷酰胺、长效类糖皮质激素（氢化可的松、地塞米松等）、长春新碱等是构建免疫缺陷型动物的常用造模剂。其中，环磷酰胺是一种烷化剂类细胞毒性药物，能够破坏DNA结构，阻断复制，杀伤快速分裂的免疫细胞，抑制动物的体液免疫和细胞免疫，造成动物免疫抑制[11，12]。本研究采用连续3天腹腔注射50 mg·kg-1环磷酰胺构建免疫抑制小鼠模型，小鼠成模后出现蜷缩弓背、活动减少、不思饮食、毛发稀疏和体重减少等特征。小鼠解剖后，观察发现与正常小鼠相比，模型小鼠脾脏和胸腺明显萎缩，这与其他文献的报道相一致[7]，可以判定环磷酰胺制备的免疫缺陷型小鼠模型成功。

脾脏和胸腺含有大量的免疫细胞，是机体最主要的免疫器官，其脏器系数能一定程度上反映机体的免疫能力和状态。实验中通过对小鼠的脾脏和胸腺系数进行检测，结果发现，免疫抑制模型小鼠在接受潞党参口服液治疗后，其脏器指数明显升高，表明潞党参口服液能够促进免疫抑制小鼠免疫器官的发育，增强免疫功能。同时，在血清溶血素形成实验中，绵羊红细胞致敏小鼠后，小鼠会产生相应的抗体即溶血素，反映了机体的特异性免疫水平。本实验结果表明，潞党参口服液中、高剂量组（6.6、13.2 g·kg-1）血清溶血素水平显著升高，提示了潞党参口服液能够对免疫缺陷小鼠特异性免疫水平起到促进作用。

淋巴细胞是机体免疫系统的基本单位，是机体免疫应答的主要承担者，其细胞数量能一定程度上反映机体的免疫应答能力和水平[13，14]。脾淋巴细胞增殖能力和功能是评价机体免疫能力的重要指标。在本研究中发现，潞党参口服液能够显著促进LPS诱导的B淋巴细胞增殖和ConA诱导的T淋巴细胞增殖，同时也能够增加巨噬细胞的吞噬指数，表明潞党参口服液对环磷酰胺所致的小鼠淋巴细胞增殖减少和吞噬功能降低有一定的恢复作用。

除免疫细胞之外，血液中的免疫因子在机体免疫反应中也具有极其重要的作用[15]。IL-4主要由活化Th2细胞所分泌，具有活化B淋巴细胞并促进其增殖产生抗体的作用；IL-2和IFN-γ主要由Th1细胞产生，IL-2在维持T细胞的分裂增殖，诱导多种免疫细胞的分化和增殖方面具有重要作用；IFN-γ具有直接促进T、B细胞分化成熟，并促进巨噬细胞吞噬功能的作用。本研究结果表明，在环磷酰胺建模小鼠血清中，IL-4、IL-2和IFN-γ因子的水平明显降低，潞党参口服液能够显著增加小鼠血清中IL-4、IL-2和IFN-γ因子的水平，表明潞党参口服液能够提高免疫抑制小鼠的免疫能力。

综上所述，潞党参口服液可以通过促进免疫器官的发育、免疫细胞增殖和提高免疫因子水平，共同对免疫抑制小鼠产生一定的调节作用。因此，潞党参口服液具有免疫增强的作用，值得为后续临床和实验研究提供参考。