痰喘半夏颗粒质量标准研究*

郭 斌 ，郭 青 ，叶晓芸

1南京中医药大学 药学院，南京 210023；2江苏省食品药品监督检验研究院，南京 210019

痰喘半夏颗粒由制半夏、川贝母、沉香等24味药组成，具有止咳、化痰、平喘的作用。用于治疗新老咳嗽，痰多气喘。现行质量标准收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第11册[1]，本品制法为：将制半夏、川贝母、肉桂、豆蔻、沉香、丁香、西洋参、白芷、细辛、天竺黄10味粉碎成细粉，与朱砂粉配研，混匀。甘草、陈皮、川芎、麸炒枳壳、麸炒白术、麸炒青皮、泽泻、麸炒白芍、山楂、制五味子、酸枣仁、干姜12味加水煎煮2次，第一次4小时，第二次3小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成清膏，加入上述粉末，拌匀，制成颗粒，干燥，过筛，喷加薄荷油，即得。市售品为盒装，3 g/袋×10袋/盒。标准中仅有性状和水分的检查，无鉴别和含量测定项目，水平低下，难以进行有效的质量控制。

痰喘半夏颗粒为国家中药标准提高行动计划的目录品种，按照国家对中成药标准提高的技术要求，对该品种现行标准进行了全面提高。采用高效液相色谱法建立了沉香的鉴别项；采用ICP-MS法对重金属及有害元素铅、镉、砷、汞、铜进行了检测并设置控制项；采用HPLC法对马兜铃酸A毒性成分和芍药苷、沉香四醇、甘草酸、甘草苷、五味子醇甲5种指标成分进行了检测，建立了毒性成分检查项和指标成分含量测定项，在合理性、综合性、可控性等方面以期达到该品的质量标准全面提高的目的。

1 仪器和材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相仪、Agilent 7700电感耦合等离子体质谱仪（美国安捷伦公司）；德国 Sartorius CPA224S万分之一电子天平；瑞士Mettler Toledo MX5百万分之一电子天平。

1.2 药品与试剂

对照品：芍药苷（纯度≥96.5%，批号110736-201035）、沉香四醇 （纯度≥98.3%，批号111980-201602）、甘草苷 （纯度≥93.1%，批号111610-201607）、甘草酸 （纯度≥93.0%，批号110731-201619）、五味子醇甲（纯度≥98.1%，批号：110855-201311）、沉香对照药材（批号 120788-201309）均购自中国食品药品检定研究院。

标准溶液：铅（标准物质号GBW08619）、镉（标准物质号GBW08612）、 砷 （标准物质号GBW08611）、汞（标准物质号 GBW08617）、铜（标准物质号GBW08615），均购自中国计量科学研究院。

10批痰喘半夏颗粒 （按编号S1至S10的批号依 次 是 20160401、20160601、20160602、20170101、20170102、20170103、20170801、20171201、20171202、20180302）和阴性样品均由贵州远程药业有限公司提供，规格均为3 g/袋。

HPLC法所用试剂为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 液相鉴别

取“2.3.3”项下溶液作为供试品溶液。另取缺沉香的阴性样品2 g，同法制备，作为阴性溶液。又取沉香对照药材0.5 g，加70%甲醇溶液10mL，超声处理30 min，滤过，取续滤液作为对照药材溶液。再取沉香四醇对照品，加甲醇制成每毫升含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。照高效液相色谱法（《中国药典》通则0512）试验，按“2.3.1”项下色谱条件操作。精密吸取供试品、阴性、对照药材、对照品溶液各20μL，依法测定。结果见图1，在供试品色谱图中，呈现与沉香四醇对照品保留时间相一致的色谱峰，并同时呈现与对照药材中另一特征峰（其相对于沉香四醇的保留时间为2.95）保留时间相一致的色谱峰，阴性无干扰。

图1 沉香液相鉴别图

2.2 检查

2.2.1 重金属及有害元素的检测

（1）质谱条件：冷却气流量：15 L·min-1；辅助气流量：0.8L·min-1；载气：0.8L·min-1；补偿气流量：0.8L·min-1；雾化器：Babington；扫描次数：3 次；采集模式：Spectrum；检测方式：自动。

（2）标准曲线溶液制备：精密吸称取Pb、Cd、As、Cu 4种元素的标准溶液适量，加10%硝酸制成含 Pb 1、5、10、20 ng·mL-1， 含 Cd 0.5、2.5、5、10 ng·mL-1，含 As 1、5、10、20 ng·mL-1，含 Cu 50、100、200、500 ng·mL-1的混合标准曲线溶液。精密吸称取Hg的标准溶液适量，加10%硝酸制成含Hg 0.2、0.5、1、2、5ng·mL-1的单元素标准曲线溶液。

（3）供试品溶液制备：取研细后的本品约0.1 g，精密称定，置于聚四氟乙烯微波消解罐中，加硝酸5 mL，密塞，按表1方法消解，消解后放冷，将消解液用去离子水分次洗涤、转移到50 mL量瓶中，并定容至刻度，摇匀，精密吸取1 mL于25mL量瓶中，用去离子水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液①。另精密吸取供试品溶液① 1mL，置250mL量瓶中，用去离子水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液②。

表1 微波消解程序

（4）方法学考察：将标准曲线溶液按浓度由小到大依次进样，得各元素的检测限、线性范围、回归方程、相关系数，见表2。结果显示，各元素在选定的浓度范围内线性关系良好。

表2 方法检测限、线性范围和相关系数结果

（5）朱砂专属性试验：取不含朱砂的阴性样品，同法制备，测得各元素的含量分别为Pb 1.08μg·g-1、Cd 0.03μg·g-1、As未检出、Hg 0.73μg·g-1、Cu 5.61μg·g-1。朱砂主要含 HgS，Hg在本品中平均含量为8398.39μg·g-1，而其阴性样品中 Hg 含量仅为 0.73μg·g-1，说明本品中Hg基本来自朱砂；其他4种元素在朱砂阴性和阳性样品中含量基本没有区别，说明处方中其他药味对重金属及有害元素有微量表现。

（6）样品测定结果：取10批本品，依法制备，供试品溶液①用于测定 Pb、Cd、As、Cu；供试品溶液②用于测定Hg。根据标准曲线计算含量。见表3。

表3 5种重金属等有害元素测定结果

2.2.2 马兜铃酸A检查

（1）色谱条件：色谱柱为YMC Hydrosphere-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-0.5%磷酸溶液（38∶62）；检测波长：320 nm；进样量：20μL。

（2）对照品溶液制备：取马兜铃酸A对照品适量，加70%甲醇制成每毫升含0.1 mg的溶液，即得。

（3）供试品溶液制备：取研细后的本品20 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加甲醇150 mL，超声处理（720 W，40 kHz）30 min，取出，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过。精密吸取续滤液100 mL，蒸干，固体物加0.5%氢氧化钠溶液30 mL溶解，分次转移到分液漏斗中，用三氯甲烷萃取3次，每次25 mL，弃去三氯甲烷液。水层用盐酸调pH至2，用三氯甲烷萃取4次，每次25 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，固体物用甲醇溶解并转移到10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，离心，取上清液，作为供试品溶液。

（4）阴性溶液制备：取缺细辛阴性样品20 g，按供试品方法制备，作为阴性溶液。

（5）专属性试验：取对照品、供试品、阴性溶液分别测定。阴性样品无干扰。见图2。

（6）检测限试验：精密吸取马兜铃酸A对照品溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密吸取此溶液1 mL，置于20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取10μL，注入液相色谱仪测定，计算信噪比S/N=3.4，马兜铃酸A的检测限为0.5155ng。

（7）样品检测：取S1~S10共10批痰喘半夏颗粒，依法测定。在10批供试品中均未检出马兜铃酸A。

图2 马兜铃酸A专属性HPLC色谱图

2.3 5种指标成分的含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱：YMC-Hydrosphere C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.5%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0 min，15%A；24 min，18%A；28 min，38%A；59 min，47%A）； 检测波长：218 nm（五味子醇甲）、235 nm（芍药苷）、250 nm（沉香四醇、甘草酸）、272nm（甘草苷）；进样量 20μL。

2.3.2 对照品溶液制备 取芍药苷、沉香四醇、甘草苷、甘草酸和五味子醇甲对照品适量，加甲醇制成每毫升含上述成分依次为195.51、42.80、91.31、77.60、3.96μg的混合对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液制备 取研细后的本品2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加70%甲醇20 mL，超声处理（720 W，40 kHz）30 min，取出放冷，用 70%甲醇补足减失重量，摇匀，离心，取上清液作为供试品溶液。

2.3.4 阴性溶液制备 取缺白芍、缺甘草、缺沉香、缺五味子的阴性样品各2g，按供试品方法分别制成阴性溶液。

2.3.5 进样精密度试验 取同一混合对照品溶液按“2.3.1”色谱条件连续进样6次。芍药苷、沉香四醇、甘草苷、甘草酸和五味子醇甲的峰面积的RSD依次为 0.97%、1.32%、0.82%、1.85%和 1.71%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.6 线性关系考察 取同一混合对照品溶液，分别进样 1、3、9、15、25、35 μL。以进样量（ng）为横坐标，以峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线。5种成分在一定的进样量范围内线性关系良好。见表4。

表4 5种指标成分的线性回归方程及线性范围

图3 5种指标成分专属性HPLC色谱图

2.3.7 专属性试验 取对照品、供试品、阴性样品溶液分别测定，见图3。在供试品中5种指标成分分离良好，阴性样品对5种成分均无干扰。

2.3.8 重复性试验 取编号为S7的供试品6份，按照“2.3.3”项下方法制备，依法测定，在6份供试品中芍药苷、沉香四醇、甘草苷、甘草酸和五味子醇甲的峰面积的RSD依次为0.70%、0.68%、1.09%、0.96%和0.73%（n=6），重复性良好。

2.3.9 加样回收率试验 取编号为S7的供试品6份，每份约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入混合对照品溶液10 mL，按“2.3.3”项下方法制备，依法测定，计算加样回收率。结果上述5种成分的平均加样回收率分别为93.33%、107.39%、100.69%、102.19%和 90.83%，RSD分别为 1.83%、1.09%、1.75%、1.60%和 1.98%（n=6）。

2.3.10 稳定性试验 精密吸取同一份编号为S7的供试品溶液，分别于 0、4、8、12、16、20、24h 进样。结果上述5种成分的RSD分别为0.47%、071%、1.10%、1.0%、0.82%（n=6），供试品溶液在24h内稳定。

2.3.11 样品测定结果 取10批痰喘半夏颗粒，依法测定，按外标一点法计算各成分的含量，见表5。

表5 样品测定结果

3 讨论

3.1 重金属及有害元素限度的制定

结合10批样品的测定结果，参照《中国药典》中甘草项下的相关规定[2]：Pb≤5.0mg·kg-1、Cd≤0.3mg·kg-1、As≤2.0 mg·kg-1、Cu≤20.0 mg·kg-1、Hg≤0.2 mg·kg-1。所有批次中的 Pb、Cd、As、Cu 的含量均远低于该标准要求，可不做限度规定。处方中朱砂以水飞后极细粉入药，投料量为24 g，制成总量1 800 g，其中含有的Hg既是有效成分，又是毒性成分。由缺朱砂阴性样品可知，本品中的Hg基本来自朱砂。《中国药典》规定水飞朱砂HgS含量不得少于98.0%[3]，相当于Hg不少于84.5%，因此本品中Hg含量应不得少于 11 266.67μg·g-1。如按样品中 Hg实测均值8 398.39μg·g-1计算，则朱砂转移率为74.5%；如按实测最低值6 142.80μg·g-1计算，则朱砂转移率为54.5%，转移率显然偏低，有可能水飞时损失严重。朱砂有毒，不宜大量服用[4]，在《中国药典》中的最大日服量为0.5 g，相当于Hg的最大日服量不得过0.43 g，本品最大日服量为9 g，如果本品中的朱砂严格按照处方量投料，则Hg的最大日服量为0.1014g，远低于《中国药典》规定的0.43 g/天。表明本品在规定的剂量下用药是安全的。为保障朱砂疗效的同时也保障其安全性，应规定Hg含量的上下限：本品中Hg的下限按照实测平均值的80%规定为20.2 mg/袋；上限按照本品中Hg的最大日服量制定为33.8mg/袋；本品Hg限度范围制定为（20.2~33.8）mg/袋。

3.2 马兜铃酸A限度的制定

处方中细辛以生粉投料，其中含有马兜铃酸类肝肾毒性化合物[5，6]，细辛的投料量为 192 g，制成总量1 800 g，如果用符合《中国药典》规定（马兜铃酸A含量≤0.001%）的细辛投料[7]，则本品中马兜铃酸A含量最高为3.2μg/袋。

3.3 5种指标成分含量限度的制定

五味子醇甲的平均含量为 0.037 mg·g-1，即0.003 7%，相当于37个ppm，由于含量过低，故不规定含量限度，以薄层鉴别即可。其余4种成分按照含量测定结果平均值的80%来规定限度：本品每袋含芍药苷、沉香四醇、甘草苷和甘草酸依次不得少于 4.3、1.0、1.8、2.0 mg。此外，本品在控制马兜铃酸A限度的同时，在后续质量研究工作中还应进行细辛脂素的含量测定研究，以保证药效。