PI3K抑制剂对2型糖尿病小鼠脑组织中乙酰胆碱酯酶表达的影响

朱霞，张亮，2，印晓星，刘耀武

(1徐州医科大学药学院江苏省新药研究与临床药学重点实验室，江苏徐州221004;2鹤壁市人民医院)

糖尿病相关认知功能障碍是近年来研究较多的糖尿病并发症之一，主要表现为学习能力障碍、思维记忆能力下降，病程进展到后期患者会出现生活不能自理，严重影响其生存质量［1］。虽然，糖尿病认知功能障碍的发病机制复杂，但中枢胆碱能神经系统功能紊乱是重要原因之一。大量研究表明，糖尿病动物表现出明显的认知功能损害，伴有大脑皮层和海马等部位的乙酰胆碱酯酶(AchE)表达增加［2～4］，AchE抑制剂能够改善糖尿病认知功能障碍［5，6］。在糖尿病脑病的发病机制中，脂质过氧化和蛋白质损害扮演着极其重要的角色。其中，丙二醛(MDA)水平是体内氧化应激活跃程度的标志物。在脑的学习和记忆功能中，特别是脑的长期记忆功能中，蛋白质翻译过程和新蛋白质合成起到至关重要的作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)作为PI3K/Akt通路下游重要的效应蛋白［7］，不仅调控蛋白质翻译，还参与蛋白质降解、核糖体合成等生理过程，而且与衰老、肿瘤、糖尿病及其并发症的发生也关系密切。例如:活化的mTORC1可磷酸化其下游蛋白70 kD核糖体S6蛋白激酶(p70S6K)，促进细胞的生长、增殖等［8］。那么，糖尿病状态下，脑内mTOR信号是否过度激活并参与了AchE合成的调控，mTOR通路对AchE蛋白合成的调控是否与PI3K/Akt通路有关，尚未可知。2017年9月～2018 年3月，我们观察了自发性2型糖尿病模型动物db/db小鼠脑组织中mTOR信号和AchE蛋白表达的变化，以及PI3K抑制剂LY294002对其的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料 12周龄2型糖尿病模型动物C57BL/KSJ db/db小鼠及同周龄非糖尿病动物C57/KSJ db/m小鼠，由南京军区总医院实验动物中心提供。试剂:PI3K抑制剂LY294002(美国Sigma公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒(杭州碧云天生物技术研究所)，葡萄糖测定试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司)，AchE检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);二硝基苯肼(上海阿拉丁试剂有限公司)，氯化四乙铵(上海源叶生物科技有限公司);mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR，Ser2448)和磷酸化p70S6K(p-p70S6K，Thr389)抗体(美国Cell Signaling公司)，p70S6K抗体(英国Abcam公司)，AchE抗体(美国Bioworld公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与干预处理 将16只db/db小鼠适应性饲养3 d后，随机分为抑制组和模型组各8只，分别腹腔注射溶于5% DMSO中的LY294002 3 mg/kg和相同体积的5% DMSO溶液。将6只同周龄db/m小鼠作为正常对照组，腹腔注射相同体积的生理盐水。各组小鼠连续给药7 d，摘除眼球采血，收集血液，分离血清;处死，剥取大脑皮质，置于－70℃冰箱保存。

1.2.2 血糖和血清MDA检测 采用Elx808IU酶标仪(美国BioTek公司)，以氧化酶法检测葡萄糖。采用HPLC-UV法检测血清MDA，按照文献［9］的方法进行:依据样本中MDA和衍生化试剂二硝基苯肼反应，生成的产物在310 nm波长处有最大紫外吸收的特点进行测定;MDA标准溶液是通过已知浓度的氯化四乙铵贮备液的酸水解而获得，然后按比例稀释得到不同浓度的标准溶液。

1.2.3 大脑皮质中AchE活性检测 采用酶底物法。取大脑皮质，用生理盐水制备成10%的匀浆，离心取上清液。BCA法测定总蛋白浓度，按照试剂盒操作步骤测定AchE。

1.2.4 大脑皮质中AchE、mTOR和p70S6K磷酸化水平测定 采用Western blotting法。取大脑皮质，用全细胞裂解液进行超声破碎，离心取上清液。BCA法测定样本蛋白浓度后，各组用裂解液配平，加上样缓冲液，沸水变性。将40 μg蛋白在SDS-PAGE凝胶系统上样电泳，湿转法将蛋白转至PVDF膜上。封闭后加一抗，4℃孵育过夜;室温下PBS洗去一抗，加入二抗室温孵育2 h。室温下PBS洗去二抗，用图像处理仪(Gene Company)软件分析图像，Image J分析软件进行灰度分析。以GAPDH为内参，分别以p-mTOR灰度值/T-mTOR灰度值、p-p70S6K灰度值/T-p70S6K灰度值表示mTOR和p70S6K磷酸化水平。以AchE与GAPDH灰度比值表示AchE相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。数据以珋x±s表示，两组间比较行t检验，多组间比较行单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血糖、血清MDA水平比较 与正常对照组比较，模型组血糖和血清MDA水平均增高(P均＜0.01);与模型组比较，抑制组血清MDA水平降低(P＜0.05)，而血糖水平差异无统计学意义。见表1。

表1 各组血糖和血清MDA水平比较(珔x±s)

＊＊正常对照组6 8.18±1.44 2.391±0.124

注:与正常对照组比较，＊＊P＜0.01;与模型组比较，#P＜0.05。

2.2 各组大脑皮质中AchE活性和表达水平比较模型组大脑皮质中AchE活性和表达量分别为(1.654±0.104)U/mg protein、0.957±0.089，高于正常对照组的(1.334±0.143)U/mg protein、0.508 ±0.222(P＜0.05或＜0.01);抑制组大脑皮质中AchE表达量(0.506±0.161)低于模型组(P＜0.05)，而与正常对照组差异无统计学意义;抑制组大脑皮质中AchE活性为(1.473±0.091)U/mg protein，较模型组没有明显降低。

2.3 各组大脑皮质中mTOR和p70S6K蛋白磷酸化水平比较 与正常对照组比较，模型组大脑皮质中mTOR和p70S6K磷酸化水平均增加(P均＜0.05);与模型组比较，抑制组大脑皮质中mTOR和p70S6K磷酸化水平降低(P＜0.05或＜0.01)。见表2。

表2 各组大脑皮质中mTOR和p70S6K蛋白磷酸化水平比较(珔x±s)

*正常对照组8 0.917±0.141 0.790±0.132

注:与正常对照组比较，*P＜0.05;与模型组比较，##P＜0.01。

3 讨论

糖尿病患者往往存在学习、记忆能力等方面的认知功能障碍，而中老年人群中即使合并轻度认知功能障碍，远期老年痴呆发生率亦可达30%～40%［10］。研究表明，氧自由基代谢和胆碱酯酶水平异常在轻度认知功能障碍发生发展过程中发挥着关键作用［11］。本研究结果显示，在自发性2型糖尿病小鼠脑内AchE表达增加，同时伴有脑内的mTOR/p70S6K通路激活;PI3K抑制剂LY294002可抑制mTOR通路激活，降低AchE表达。这表明在2型糖尿病状态下脑内AchE表达上调，而PI3K/Akt/mTOR通路激活可能介导了这一作用。该发现为糖尿病认知功能障碍的防治提供了新思路。

在高糖条件下，氧化应激增加引起海马组织结构异常，导致学习记忆功能障碍［12，13］。糖尿病大鼠认知功能障碍时，AchE表达增加，伴随着体内氧化应激水平的增加，如脑内抗氧化系统减弱及脂质过氧化水平增加［2～4，14］。另外，抗氧化剂可显著降低AchE表达从而改善糖尿病认知功能障碍［4，14，15］。Dabidi等［16］发现，氧化应激造成脑组织损伤，随着病程的进展，脑损伤逐渐积累，导致神经细胞变性甚至坏死，进而发生中枢神经系统慢性不可逆性损伤，导致糖尿病认知障碍的发生。MDA是脑组织脂质过氧化产物，特别是脑组织损伤时，大量氧自由基可以使脂质过氧化，所以MDA水平可以提示糖尿病时氧化应激活跃程度。本研究结果显示，模型组血清MDA水平较正常对照组增加，表明氧化应激在糖尿病认知功能障碍发生发展中有重要作用;而抑制组给予PI3K抑制剂LY294002后可以降低血清MDA水平，提示PI3K抑制剂能减少脑内氧化应激的损伤程度。

乙酰胆碱广泛参与到机体的高级神经功能活动中，而作为其水解酶，AchE具有调节神经功能、改善大脑思维及记忆等多方面的作用。许多研究已表明，糖尿病认识功能障碍的发生与脑内AchE功能障碍有关，AchE活性上升可引起认知功能下降，且绝大部分轻度认知功能障碍患者合并胆碱能神经功能下降［2～6］。本研究结果表明，在自发性2型糖尿病db/db小鼠脑内AchE表达增加，伴有血中脂质过氧化产物MDA水平增加。这说明糖尿病状态下氧化应激可能有助于AchE的损害，这与文献［3，4］的报道相一致。

PI3K是生长因子受体超家族信号转导通路中的重要激酶，PI3K磷酸化后激活Akt进而参与众多生物学过程的调控。mTOR属于磷脂酰肌醇相关激酶家族成员，是PI3K/Akt通路下游的重要效应蛋白。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，介导多种细胞信号传递并调节转录、翻译、自噬及核糖体合成等过程，在细胞生长和增殖分化等方面起着至关重要的作用。研究发现，mTOR调控蛋白质翻译，而且与糖尿病及其并发症的发生有密切关系［8］。作为一种功能广泛的大分子蛋白质，mTOR可在多个位点发生磷酸化，如Ser1261、Thr2446及Ser2448等，磷酸化的mTOR可进一步激活下游靶分子进而调节细胞活动。其中，Ser2448磷酸化是mTOR接受上游Akt信号的主要位点［17］。p70S6K是mTOR最重要的下游位点之一。在高糖条件下，细胞内mTOR被磷酸化激活，导致其下游通路p70S6K过度表达。在本研究中我们发现，2型糖尿病db/db小鼠大脑皮质mTOR通路被激活，即mTOR及其下游激酶p70S6K的磷酸化水平均增加，表明脑内AchE表达上调可能与mTOR通路激活有关。

由于PI3K/Akt是调控mTOR信号的重要通路之一［7］，本研究对慢性2型糖尿病db/db小鼠腹腔注射PI3K抑制剂LY294002后，其大脑皮质AchE表达降低、mTOR/p70S6K通路被抑制，提示PI3K/Akt/mTOR通路激活介导了糖尿病状态下脑内AchE的表达上调。研究表明，氧化应激可以激活PI3K/Akt/mTOR信号通路，阻断该通路可以减少视网膜上皮细胞的凋亡［18］。大量研究表明，ROS过多激活了PI3K/Akt/mTOR通路，促进了糖尿病并发症如肾病和心血管疾病的发生［19，20］。本研究发现，PI3K抑制剂LY294002可以通过降低氧化应激水平，从而抑制mTOR及下游p70S6K的磷酸化。在本研究中PI3K抑制剂LY294002对db/db小鼠的血糖无明显影响，从而排除了PI3K抑制剂通过影响血糖而间接影响mTOR通路的可能。Ma等［21］报道，在2型糖尿病大鼠海马中，mTOR通路激活可能与胰岛素信号通路损害有关，进一步说明PI3K/Akt通路可能参与了糖尿病状态下脑内mTOR通路的激活。此外，我们前期研究［22］发现，在高糖培养的中枢神经细胞系HT-22细胞及1型糖尿病大鼠脑内AchE表达上调与PI3K/Akt/mTOR通路激活有关。

综上所述，在糖尿病状态下大脑皮质AchE表达发生上调，这与PI3K/Akt/mTOR通路激活有关，可能为糖尿病性认知功能障碍发生的机制之一。PI3K抑制剂LY294002是通过降低氧化应激水平，抑制mTOR相关通路的活性，减少AchE表达，从而发挥脑保护作用，可为糖尿病相关认知功能障碍的防治提供研究靶点。