波形蛋白、锌指蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达变化及其相互关系

俞立萍，邓周峰，万剑慧，林宏坚

(上海市同仁医院，上海200336)

流行病学研究显示，非小细胞肺癌(NSCLC)发病率可达273～483/10万，特别是近3年其发病率上升趋势明显[1，2]。不同肿瘤相关蛋白的表达，均能影响肺泡上皮细胞的生物学特征，促进恶性肿瘤的发生和病情进展。研究发现，波形蛋白(Vimentin)主要表达于上皮组织和基底膜组织中，能促进上皮细胞间的缝隙连接和紧密连接的分解，可影响上皮细胞的极性和形态[3]；锌指蛋白(Slug蛋白)表达能通过促进上皮细胞间质成分的分解，提高肿瘤细胞的黏附和侵袭能力[4，5]。为深入探讨Vimentin、Slug蛋白表达与NSCLC发生发展的关系，本研究检测了Vimentin、Slug蛋白在NSCLC组织中的表达变化，并分析二者的相互关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2015年1月～2017年8月上海市同仁医院手术治疗的NSCLC患者，本研究获得医院医学伦理委员会批准。纳入标准：①符合2014年NCCN指南中NSCLC诊断标准；②术后经病理学或纤维支气管镜取活组织证实；③术前未行放化疗或免疫治疗；④术中留取肿瘤组织或者癌旁组织；⑤患者或家属知情并签署知情同意书。排除标准：①转移性肺癌；②长期使用免疫抑制剂等药物；③HIV感染。共选取90例患者的NSCLC病理标本组织(NSCLC组)及其中45例患者的癌旁组织(对照组)。NSCLC组患者中男53例、女37例，年龄(56.2±9.6)岁，鳞癌10例、腺癌80例，肿瘤分化程度为高分化26例、中分化30例、低分化34例，TNM分期Ⅰ期27例、Ⅱ期38例、Ⅲ期22例、Ⅳ期3例，发生淋巴结转移51例。对照组患者中男28例、女17例，年龄(58.0±10.3)岁，鳞癌5例、腺癌40例，肿瘤分化程度为高分化10例、中分化18例、低分化17例，TNM分期Ⅰ期15例、Ⅱ期20例、Ⅲ期8例、Ⅳ期2例，发生淋巴结转移27例。两组性别、年龄等临床资料具有可比性。

1.2 Vimentin、Slug蛋白检测方法 采用免疫组化法。取石蜡标本进行连续性切片，脱蜡至水；采用H2O2室温下孵育10 min，磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次3～5 min；加8%的蛋白粉封闭液(BSA，南京博奥生物科技公司)，封闭2 h；倒去封闭液后加入一抗(兔源，浓度1∶1 000～1∶1 500)，4 ℃冰箱过夜；磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次3～5 min。加入二抗(鼠源，1∶400～1∶500)，室温孵育20～30 min；磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次3～5 min。加入辣根酶或碱性磷酸酶标记物，室温孵育10 min；磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次3～5 min；滴加显色剂(DAB，南京博奥生物科技公司)，复染，脱水，封片。染色分析的结果判定：Vimentin蛋白主要分布于细胞质中、Slug蛋白主要分布于细胞核或细胞质，两种蛋白阳性染色在显微镜下均表现为黄色、棕黄色甚至褐色。依据染色强度评分：无染色为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、褐色甚至更深为3分；依据阳性染色细胞比例评分：≤10%为1分、11%～50%为2分、51%～75%为3分、>75%为4分。染色强度与染色阳性细胞比例评分相乘，≥3判为阳性表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计数资料以例或率表示，组间比较行χ2检验，相关关系行Spearman秩相关分析法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组Vimentin、Slug蛋白阳性表达情况比较 NSCLC组Vimentin、Slug蛋白阳性表达率分别为57.78%(52/90)、68.89%(62/90)，对照组分别为8.89%(4/45)、13.33%(6/45)，NSCLC组Vimentin、Slug蛋白阳性表达率均高于对照组(χ2=29.539、37.039，P均<0.05)。

2.2 NSCLC组不同病理特征NSCLC组织中Vimentin、Slug蛋白表达比较 TNM分期Ⅲ期和Ⅳ期、发生淋巴结转移的NSCLC组织中Vimentin蛋白阳性表达率高于TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期、未发生淋巴结转移的NSCLC组织(P均<0.05)，TNM分期Ⅲ期和Ⅳ期、发生淋巴结转移、低分化NSCLC组织中Slug蛋白阳性表达率高于TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期、未发生淋巴结转移、高分化及中分化的NSCLC组织(P均<0.05)。见表1。

表1 NSCLC组不同病理特征NSCLC组织中Vimentin、Slug蛋白表达比较

2.3 NSCLC组Vimentin蛋白、Slug蛋白表达的关系 相关分析显示，NSCLC组中Vimentin蛋白与Slug蛋白表达呈正相关(r=0.640，P<0.05)。

3 讨论

环境、遗传等因素均能诱导NSCLC的发生，促进NSCLC临床病理特征的进展。作为呼吸系统常见的恶性肿瘤，NSCLC无瘤生存时间不足38个月，包括手术在内的相关综合性治疗后的3年病死率仍>35%[6,7]。另外，现阶段临床上缺乏对于NSCLC早期诊断的有效生物学血清分子，也是导致患者生存期较短的主要原因。本研究观察了Vimentin、Slug蛋白在NSCLC组织中的表达变化，旨在探讨NSCLC的发生机制，为NSCLC的免疫靶向治疗提供基础，为NSCLC早期高危人群的血清学筛查提供依据。

研究发现，某些生物学因子的浓度波动，能够在促进肿瘤细胞的早期核异型性发生，或中晚期临床病理特征进展过程中发挥重要作用。其能够调控肿瘤细胞的生物学特性，干预肿瘤细胞的扩散和转移速率等，进而影响到患者的整体生存预后。Vimentin表达能够促进细胞间连接蛋白的分解，降低了上皮细胞间的黏附能力[8,9]。Vimentin对于肿瘤细胞微丝和微管蛋白的激活作用，能够提高上皮细胞的变形和浸润能力。近年来基础方面的相关研究还认为，Vimentin是重要的信号通路激活因子，其对于HIPPO信号通路的激活作用，能够提高NSCLC上皮细胞核DNA的转录风险，增加肿瘤细胞的调控异常风险[10]。Slug蛋白能够参与到上皮-间质转化过程，其对于肿瘤细胞间质成分的分解作用，能够为肿瘤细胞浸润基底膜组织提供前提；Slug蛋白表达还能提高肿瘤细胞对于基底膜内皮细胞的黏附能力，增强肿瘤细胞对内皮下血管的浸润能力[11]。

本研究结果显示，Vimentin、Slug蛋白在NSCLC患者病灶组织中阳性表达率均较癌旁组织上升，提示Vimentin、Slug蛋白高表达均能影响NSCLC的发生过程。通过分析相关文献，我们认为这与Vimentin、Slug蛋白以下的病理生理作用机制有关[12～14]：①Vimentin蛋白表达上升能够提高肿瘤细胞肌动蛋白的活性，提高肿瘤细胞侵袭和转移能力；②Slug蛋白表达上升能够提高恶性肿瘤上皮-间质转化的速度，促进肿瘤细胞对于基底膜的浸润过程。岳银艳等[15]也发现，在NSCLC患者肿瘤组织中，Slug蛋白阳性表达率明显上升，平均升幅超过25%，在发生远处转移或临床分期进展的患者中Slug蛋白表达上升更明显。相关分析可见，Vimentin、Slug蛋白表达具有内在的正相关关系，提示二者在促进NSCLC病情进展过程中可能发挥一定的协同作用。这主要与Vimentin、Slug蛋白表达均能够影响到肿瘤细胞的浸润能力，促进了上皮-间质转化过程有关。对NSCLC患者临床病理特征的分析研究可见，在临床分期较晚或发生淋巴结转移的患者中，Vimentin蛋白阳性表达率明上升，提示Vimentin蛋白表达对NSCLC患者临床病程有影响。这主要与Vimentin蛋白表达上升能够促进肿瘤细胞对临近正常肺部组织的浸润，增加了肿瘤细胞对于淋巴结内皮细胞的黏附过程有关。而在临床分期较晚、发生了淋巴结转移或者肿瘤细胞分化程度较差的患者中，Slug蛋白表达也上升，表明Slug蛋白表达与NSCLC的临床病理特征有关系。这主要与Slug蛋白表达不仅能影响到肿瘤细胞浸润基底膜组织的能力，同时还能够影响到肺泡上皮细胞的分化成熟能力。由此可见，在NSCLC患者中，Vimentin、Slug蛋白表达均上升，二者与肺癌患者的临床病理特征的进展密切相关，在促进肺癌的发生发展中起到一定的协同作用。因此，Vimentin、Slug蛋白可用于NSCLC的诊断、病情判断，作为治疗靶点亦有一定临床价值。