重组人促红细胞生成素对肝细胞模拟缺血/再灌注损伤的保护作用

李龙，温陈，解维敏，刘文玉，刘波，陶开山，窦科峰，慕喜喜，3（.神木市医院肝胆外科，陕西 神木 79300；.空军军医大学西京医院肝胆外科，陕西西安 7003；3.西安市中心医院普通外科，陕西 西安 70003）

由于移植外科技术的成熟以及新型免疫抑制药物的开发，越来越多的终末期肝功能衰竭患者选择进行肝移植来挽救生命，由此造成严重的供肝短缺，并引起边缘供肝的使用逐渐增加，但是此类供体肝脏对缺血/再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）十分敏感，常常预后不良[1-2]。尽管有学者已开始尝试无血流阻断肝移植，并取得初步成果[3-4]，但IRI仍是肝移植手术中无法避免的重要环节，严重影响移植肝的预后[5]。在移植肝IRI过程中伴随着活性氧自由基的释放，由此引发氧化损伤[6]，常常导致细胞凋亡、坏死，包括引发细胞过度自噬死亡[7]。自噬（autophagy）是细胞利用胞内溶酶体降解受损、变性、衰老的蛋白质，实现物质和能量的回收利用，从而维持细胞稳态，但自噬活性过高会诱发细胞Ⅱ型程序性死亡[8]。促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）主要由肾脏分泌促进红细胞生成来应对缺氧。有研究表明，EPO还具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，有学者认为其可能是一种细胞保护因子[9]。重组人促红细胞生成素（recombinant human erythropoietin，rhEPO）是通过DNA重组生产的EPO，其序列和生物活性均与内源性EPO相同。本研究拟采用H2O2建立肝细胞缺氧/复氧培养模型，探索rhEPO处理对肝细胞模拟IRI的保护作用，以及与肝细胞自噬活性的关系，揭示其可能涉及的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料：大鼠肝细胞株BRL3A购于上海中科院细胞库。rhEPO购自克隆生物高技术有限公司。30% H2O2试剂购自国药集团化学试剂有限公司。吖啶橙染色试剂盒购自Sigma。CCK-8检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。Western blot检测抗体：anti-LC3B、anti-p62、anti-p-p85（1∶1 000）、anti-p85（1∶ 500）购自Abcam，anti-p-AKT（1∶500）、anti-AKT （1∶1 000）购自CST，anti-βactin （1∶300）购自Abmart，HRP标记的二抗购自碧云天生物技术有限公司。PrimeScript RT Master Mix试剂盒购自Takara。BCA蛋白检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。天冬氨酸转氨酶 （aspartate aminotransferase，AST）和丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）测定试剂盒购自Sigma。

1.2 细胞培养与分组：取指数生长期的BRL3A细胞，按照2000个 （100 μl·孔） 的密度种植于96孔板，加入H2O2（终浓度为200 μmol/L）刺激细胞2 h，取3代培养的BRL3A细胞随机分为4组：① 正常对照组；② H2O2处理组；③ H2O2+10 U/ml rhEPO处理组；④ H2O2+ 20 U/ml rhEPO处理组，每组分为6个复孔。

1.3 细胞存活率的检测：将各组细胞继续培养4 h后，采用CCK-8测定细胞存活率，每孔（200 μl体积溶液）加入10 μl的CCK-8溶液，然后用加入了相应体积的细胞培养液以及CCK-8溶液，不含细胞的孔作空白对照。放入培养箱内继续孵育约1 h左右，用酶标仪检测，在450 nm测定吸光度值。各孔OD值为实际OD值减去空白对照组OD值，每组复孔去掉最大值和最小值 （n＝6孔），取均数。重复实验（n＝3次），根据结果绘制细胞存活曲线。

1.4 转氨酶释放测定：取各组培养细胞的上清液，按照试剂盒说明书的方法，化学比色法测定培养液中AST、ALT的含量。

1.5 吖啶橙染色检测肝细胞自噬小体形成：24孔板培养孔中加入细胞爬坡玻璃片（预先消毒处理），按上述实验分组，每组3个复孔。将各组细胞继续rhEPO处理4 h后，去除培养基，无菌PBS洗3遍，然后向各孔中加入吖啶橙荧光染色液，保持吖啶橙染液终浓度20 μg/ml，进行室温孵育约15 min。移除染色液后，用无菌的PBS清洗约4遍，置于倒置荧光显微镜下，观察染色结果。

1.6 Western Blot检测：样品中加入蛋白酶抑制剂后，在冰上裂解细胞，提取蛋白99℃变性10 min。BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。制作10%的SDS-PAGE分离胶，蛋白上样后电泳，110 V，120 min。转膜，220 mA，40 min。5%牛奶封闭后，加入一抗4℃孵育过夜。用辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h。最后用ChemiDocTM XRS +和Image Lab TM software显影，并计算条带灰度值。

2 结 果

2.1 rhEPO可以逆转H2O2导致的BRL3A细胞存活率下降（表1、图1）：H2O2处理后的BRL3A细胞存活率明显下降（95.36±3.12%比57.82±2.54%，P＜0.05），经过不同浓度的rhEPO处理后，BRL3A细胞存活率有不同程度升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 BRL3A细胞存活率（±s）

表1 BRL3A细胞存活率（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与200 μmol/L H2O2处理组比较，bP＜0.05

组别 例数（例） 存活率（%）正常对照组 3 95.36±3.12 H2O2处理组 3 57.82±2.54a H2O2 +10 U/ml rhEPO处理组 3 72.55±2.79b H2O2 +20 U/ml rhEPO处理组 3 81.63±3.45b

图1 CCK-8测定各组BRL3A细胞存活率

2.2 各组BRL3A细胞上清中转氨酶的含量（表2、图2）：H2O2处理后的BRL3A细胞上清中AST和ALT的释放量明显增加〔AST（U/L）：574±21.34比75±11.63；ALT（U/L）：378±16.42 比 66±10.21，P＜0.05〕；经过不同浓度的rhEPO预处理，AST和ALT的释放量明显下降，与200 μmol/L H2O2处理组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组细胞培养上清中转氨酶比较（IU/L，±s）

表2 各组细胞培养上清中转氨酶比较（IU/L，±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与200 μmol/L H2O2 处理组比较，bP＜0.05

组别 例数（例） AST ALT正常对照组 3 75±11.63 66±10.21 H2O2处理组 3 574±21.34 378±16.42a H2O2 +10 U/ml rhEPO处理组 3 392±32.52 220±13.73b H2O2 +20 U/ml rhEPO处理组 314±16.27 193±11.89b

图2 化学比色法检测培养上清中AST和ALT含量

2.3 rhEPO能明显抑制H2O2导致的BRL3A细胞致死性自噬活性，使胞内自噬小体明显减少（图3）：为测定各组BRL3A细胞的自噬活性，本研究中采用吖啶橙染色。正常对照组BRL3A细胞自噬活性水平较低，经H2O2处理后，BRL3A细胞自噬活性明显升高，胞内酸性小体增加，发生自噬性死亡。给予不同浓度的rhEPO处理后，BRL3A细胞自噬活性得到明显抑制，其中20 U/ml rhEPO处理组的胞内酸性小体的数量明显减少，和H2O2组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 rhEPO处理能明显抑制LC3-Ⅱ蛋白表达，同时p62蛋白增多（图4）：LC3B蛋白分子两个亚型，两者的比例可以反映细胞自噬的活性强弱，当自噬增强时，形成酸性自噬小体，使LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转变，同时，随着细胞自噬活性增强，自噬相关蛋白p62会成比例的降解。与对照组相比，H2O2处理可引起BRL3A细胞自噬活性增加，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转变，同时，自噬相关蛋白p62被大量降解，差异具有统计学意义（P＜0.05）。给予rhEPO处理后，特别是在20 U/ml rhEPO浓度下，BRL3A细胞自噬活性被明显抑制，与H2O2处理组比较，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例显著下降，同时伴随有p62蛋白的重新堆积，提示BRL3A细胞致死性的自噬行为被逆转。

图3 吖啶橙染色检测BRL3A细胞胞内自噬小体的形成

图4 Western-Blot检测各组培养BRL3A细胞中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和p62的表达变化

2.5 rhEPO处理能显著增加p-p85和p-AKT表达，活化PI3K/AKT信号通路（图5）：检测p85和AKT的磷酸化蛋白p-p-p85和p-AKT的表达量，观察信号通路PI3K/AKT的活化水平。与正常对照组相比较，H2O2处理可引起BRL3A细胞p-p85和p-AKT的表达量下降。给予rhEPO处理后，磷酸化蛋白p-p85和p-AKT的表达又出现增多，这和BRL3A的自噬活性变化水平相一致。

3 讨 论

多种肝脏外科操作中，如肝切除、肝移植等，肝脏组织都将不可避免的面临组织IRI[10]。然而，迄今为止，其具体的损伤机制尚未完全阐明，在临床上也始终缺乏有效的干预手段。研究证实，无氧代谢与酸中毒、钙离子超载、氧自由基的生成、细胞凋亡、内皮素、肝脏微循环衰竭、补体系统、热休克蛋白等均参与其中[11]。

图5 Western Blot检测各组培养BRL3A细胞中PI3K/AKT信号通路蛋白p-p85和p-AKT的表达变化

缺氧/复氧模型是体外从细胞水平研究IRI的理想模型[12]，且有研究证实利用H2O2可成功建立细胞缺氧/复氧损伤模型[13]。本研究通过建立肝细胞模拟缺血/再灌注损伤的体外培养模型，利用H2O2释放的活性氧自由基，造成大鼠BRL3A肝细胞的氧化应激损伤，然后给予rhEPO观察其对细胞损伤的防御或修复效应，结果显示，其能有效提升氧化应激环境下肝细胞的生存能力。既往研究发现EPO不仅能够促进红细胞生成，提高机体的携氧能力，改善组织器官缺氧，同时还具备许多特殊的生理功能，如抗炎[14-15]、抗凋亡[16]、促进血管生成[17]等。我们的结果说明，EPO具有显著的抗氧化损伤功能，且这种保护作用与rhEPO浓度呈正相关。

值得注意的是，近年来，许多学者还发现肝脏IRI过程中还存在着特殊的细胞生理活动，即自噬现象[18]。生理状况下，肝脏组织细胞保持着低水平的自噬活性，通过物质和能量循环来维持细胞的稳态[19]。但在一些应激条件下，这种自噬活性会被放大，打破这种稳态平衡，形成细胞Ⅱ型程序性死亡，称之为自噬性死亡[20-21]。本研究中在给予H2O2刺激后，吖啶橙染色可观察到肝细胞胞质中出现大量的酸性自噬小体，同时，可检测到微管相关蛋白1轻链3（microtubuleassociated protein 1 light chain 3，LC3/Atg8）亚型LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转变，且p62大量降解[22]，提示H2O2加强了肝细胞的自噬活性，结合细胞存活率下降，我们推测这种过度强化的自噬现象即为致死性细胞自噬。自噬涉及多种信号调节通路，如PI3K/AKT/mTOR[23]、MAPK/ERK1/2[24]、p53/Genotoxic Stress[25]、AMPK[26]等，其中最为经典的即为PI3K/AKT/mTOR信号通路，PI3K/AKT的磷酸化可促进mTOR的活化，对细胞自噬产生明显的抑制作用，反之，即可启动细胞自噬[27-28]。研究证实，mTOR作为该通路的关键效应分子，激活的mTOR，即p-mTOR可以抑制以及破坏自噬体的形成，反馈调节细胞的自噬水平[28-29]。本研究中 H2O2刺激细胞后，p-p85和p-AKT的表达明显下降，说明PI3K/AKT的磷酸化程度变低，提示PI3K/AKT信号被抑制，细胞自噬过程被加强，即形成过度激活现象，导致肝细胞死亡。给予rhEPO处理后，p-p85和p-AKT的表达回升，PI3K/AKT的磷酸化导致mTOR被激活，自噬效应得到明显的抑制。本研究的不足之处在于没有进一步做mTOR的蛋白水平检测，以进一步验证我们的猜想，后续需要进一步检测磷酸化mTOR，完善相关的分子机制。