益气养阴通络法通过JAK/STAT通路对急性心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡的影响

急性心肌缺血表现为冠状动脉的急性闭塞所致的心肌细胞缺血、缺氧、凋亡的一系列过程，为临床常见病，威胁着人类健康。有研究表明，急性心肌梗死后的心肌细胞中存在细胞凋亡[1]。JAK-STAT信号通路在心肌缺血再灌注过程中对心脏有重要的保护作用[2]，当其受到抑制，可激活Caspase-3前体，启动细胞凋亡[3]。本研究采用具有益气养阴通络功效的双参通脉颗粒干预大鼠急性心肌缺血模型，观察其对JAK/STAT通路的影响，探讨中药干预心肌细胞凋亡的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 双参通脉颗粒，由辽宁中医药大学附属医院制剂室提供，由人参、黄芪、麦冬、当归、丹参、川芎等组成，采用传统颗粒制备方法，批号 20160531。盐酸地尔硫卓片，天津田边制药有限公司生产，每片30 mg，国药准字： H12020126。麻醉药水合氯醛(上海化学试剂有限公司，批号分别为 20130413，20131127)，现用现配； EliVision plus试剂盒(中国福州迈新生物科技有限公司kit-9902)，DAB Kit(中国福州迈新生物科技有限公司DAB-1031)，苏木素染色液(中国南京建成公司 D005)，Invent 总蛋白提取试剂盒(美国 Invent SD001/SN002)。

1.1.2 实验仪器 MP150 多导生理信号采集系统(德国Leica公司)、高速台式离心机(德国Eppdendorf公司)、BB23型培养箱(美国PE公司)、ROTEAN 电泳系统(美国Bio公司)、冰冻切片机OM3123 型(瑞典Bio公司)、恒温恒湿箱(上海科技生物公司)、多功能酶标仪(美国Cell Signaling公司)等。

1.2 方法

1.2.1 分组及造模方法 选取健康SD大鼠，共60只，随机分为6组，即假手术组、模型组、西药组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组，每组10只。对模型组、中药各剂量组、西药组实验动物进行造模，复制急性心肌缺血模型。取大鼠称重，采用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g，腹腔麻醉后固定于手术台上，气管切开，呼吸机辅助呼吸(频率 85 次/min，潮气量 18 mL，吸呼比1∶1)，连接心电检测仪，术中记录Ⅱ导联心电图。于左冠状动脉前降支起始下2 mm处结扎，假手术组不结扎，检查无出血，逐层关闭胸腔。

1.2.2 给药方法 按人和动物等效剂量换算法折算大鼠剂量进行换算，假手术组及模型组予生理盐水灌胃每次3 mL，每日2 次。西药组予以盐酸地尔硫卓片灌胃，剂量为4.23 mg/kg。中药低剂量组给予相当生药量9.37g/(kg·d)；中药中剂量组给予相当生药量18.75 g/(kg·d)；中药高剂量组给予相当生药量37.5 g/(kg·d)，均制成 6 mL，每次3 mL，每日2 次，疗程2周。

1.2.3 血流动力学测定 取材前分离右侧颈总动脉，左心导管插管至左心室，由 ALC-MPA 多导生物信号分析系统记录血流动力学参数。

1.2.4 免疫组化法检测P-STAT3蛋白表达 取心肌组织连续2块厚2～3 mm，将标本固定于4%多聚甲醛中，观察各级乙醇脱水，石蜡固定进行常规切片，按常规方法进行脱蜡，水合，再于二甲苯、各级乙醇中脱水，抗原修复，抗原-抗体反应，苏木精-伊红(HE)复染，二甲苯透明、滤纸吸干、中性树胶封片，光学显微镜下观察组织细胞中蛋白的表达情况。

1.2.5 蛋白提取及指标检测 取缺血心肌组织数块，提取蛋白，进行蛋白定量，SDS-PAGE电泳。采用Western blot方法测定心肌细胞中的Caspase-3蛋白表达。

2 结 果

2.1 各组大鼠左心室功能检测 治疗结束后中药各剂量组大鼠血流动力学参数均发生了改变，与模型组相比，各治疗组左心室收缩功能(LVSF)明显升高(P<0.05)，左心室舒张功能(LVDF)显著降低(P<0.05)； 中药高剂量组血流动力学改善最明显。详见表1。

表1 各组大鼠左心室功能比较(±s)mmHg

与假手术组比较，1)P<0.05； 与模型组比较，2)P<0.05，3)P<0.01

2.2 各组大鼠P-STAT3蛋白表达 与假手术组比较，模型组P-STAT3蛋白表达明显降低；与模型组比较，各治疗组P-STAT3蛋白表达均升高，其中，中药高剂量组蛋白表达升高明显。详见图1、表2。

假手术组 模型组 西药组

中药低剂量组 中药中剂量组 中药高剂量组

图1各组大鼠P-STAT3蛋白表达

表2 各组大鼠P-STAT3蛋白表达光密度平均值(IOD/area)比较(±s)

与假手术组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05

2.3 各组大鼠心肌细胞中Caspase-3蛋白表达 与假手术组比较，模型组Caspase-3表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，西药组、中药高剂量组、中药中剂量组Caspase-3表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.01) 。中药高剂量组与西药组、中药中剂量组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。详见图 2。

与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，**P<0.01

图2Westernblotting检测各组Caspase-3蛋白表达

3 讨 论

JAK/STAT通路参与了多种细胞因子和生长因子介导的信号传递，心肌缺血缺氧产生多种细胞因子，激活 JAK-2，启动 JAK/STAT 信号通路，使 STAT3 磷酸化，P-STAT3二聚化后转入核内，诱导目的基因表达，转录合成 Bcl-2等多种心肌保护因子，介导心肌保护作用[4-5]。当通路被阻断，Bcl-2蛋白表达下降，Bax蛋白表达增高，激活下游的凋亡效应酶 Caspase-3，使细胞调节、细胞信号转导、DNA 修复、组织平衡、细胞存活等环节中的重要蛋白水解，从而出现细胞凋亡[6]。Caspase-3作为终端剪切酶，主要于细胞质及细胞核中表达，被称为细胞凋亡的执行者。

现代药理研究表明，中药具有调控心肌细胞凋亡，抗氧自由基损伤，减轻炎症反应，抑制钙离子超载等作用[7]。本研究选用具有益气养阴通络功效的双参通脉颗粒，由人参、黄芪、麦冬、当归、丹参、川芎六味药物组成。方中人参、黄芪补益元气，当归、丹参活血养血，川芎引血上行，麦冬益胃生津，全方散中有补，补而不腻。气虚则无以行血，阴虚则脉络不通，气阴两虚、心血瘀阻为胸痹心痛病机之一。现有研究表明，人参皂苷Re预处理对急性心肌缺血大鼠心肌有较好的保护作用，该作用可能与激活JAK2/STAT3 通路有关[8]。丹参酮ⅡA 可降低缺血再灌注诱导的大鼠心肌细胞凋亡，其保护机制可能与调节JAK2/STAT3 信号通路有关[9]。丹参可抑制心肌细胞凋亡，其机制与调控BAX、Bcl-2蛋白表达有关[10]。

益气养阴通络法能够抑制急性心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡，其机制可能与上调P-STAT3蛋白表达、下调Caspase-3蛋白表达有关。