不同类型酱油挥发性组分及多重辨析的研究

隋明，张凤英，胡继红，李俊儒，刘根娣，牛广财

(1.四川工商职业技术学院，四川 都江堰 611830；2.四川大学 轻纺与食品学院， 成都 610065；3.奥克兰大学 医学与健康科学学院，新西兰 奥克兰 1052； 4.西北民族大学 生命科学与工程学院，兰州 730010)

酱油主要富含的营养物质是氨基酸态氮，王鹏等使用黑豆为原料生产的黑豆酱油中氨基酸态氮含量超过了0.8 g/dL，达到了一级酱油的标准，此外，酱油还含有抗癌作用的异黄酮、抗衰老作用的原花青素等，营养价值颇高[1]。辅以糟糠、稻壳等多种不同类型的农业副产品进行酿造，反而可以获得具有独特香味的酱油产品。张丽等将薏仁米生产过程中的碎渣作为酱油制曲的辅助淀粉质原料，不仅提高了食品废料的利用价值，还增加了产品的营养价值[2]。酱油除了增鲜味、增咸外，挥发的香气不仅可增加顾客的购买欲望，同时也是酱油不同种类辨析的重要指标。在酱油酿造生产过程中，大豆、面粉作为主要的生产原料，也有加入麸皮、稻壳作为辅料生产酱油的工艺，因此分为两种类型的酱油并在微生物的发酵下形成具有特色的调味品。

酱油制曲过程中米曲霉酶解豆类原料中的蛋白质生成小分子肽和氨基酸类，能够提供酱油的鲜味[3]；淀粉酶将小麦粉中的淀粉降解为麦芽糊精和小分子糖类，经过后期蒸煮、焦糖化作用、美拉德反应等也都增加了酱油的风味[4]；酱油酿造过程中脂肪酶酶解豆类分泌出的油脂，可能会导致油脂酸败生成异味，但经过后期的微生物、氧化作用，生成小分子的醛、酮、醇、酯类等香味物质[5]。

1 酱油中挥发性组分的测定方法

日本是研究酱油中挥发性香气测定方法最早的国家之一，早在1966年开始就对酱油中所含的香气成分进行了研究与报道，通过控制原料、工艺，生产了不同品种的酱油，如：白酱油、清淡酱油、浓香酱油等，同时对其挥发性组分进行了分析测定，对单体挥发性化学分子成分开展了具体的研究，见表1。

表1 酱油中的挥发性香气成分Table 1 Volatile aroma components in soy sauce

续 表

Nunomura等认为对酱油挥发性香气贡献最大的气体是4-乙基愈创木酚[6]，通过使用气-质联用的方法来鉴定的化合物有15种醇、15种碳酸、9种酯、4种内酯、6种醛、3种呋喃、5种吡喃、7种酚、13种酸和16种其他化合物，它们中的焦糖状香气化合物对特种酱油的特色风味很重要。其中，4-羟基-2-乙基-5-甲基-3-呋喃酮-羟基-5是酱油挥发性香味中最为重要的组成成分。随后，Nunomura等做了进一步的研究，将酿造酱油的成分主要分成3个部分，即中性、酸性和碱性。4-羟基-2(或5)-乙基-5(或2)-甲基-3(2H)-呋喃酮(HEMF)和4-羟基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮似乎很重要，特别是考虑到其含量和有机分子性质，生姜是生姜特色酱油风味的主要成分，见图1。

图1 生姜风味酱油质谱图Fig.1 Mass spectrogram of ginger flavored soy sauce

Ling等在研究中得出，酱油在发酵过程中传统原料成分与挥发性化合物质的组成具有一定的相似之处。Yan L采用顶空固相微萃取(HS-SPME)和气相色谱-质谱(GC-MS)测定酱油中挥发性风味成分[7]，采用该方法对酱油样品进行评价，发现醇类、羧酸类、酯类和酚类是酱油中主要的风味物质，同时还发现了一些氧化合物和杂环化合物。 Wang P等采用HPLC-MS/MS法测定传统酿造酱油中主要杂环芳香族胺(HAAs)的含量[8]，研究动物种类及成分(酱油、冰糖、米酒)对卤化肉制品中HAAs形成的影响。结果表明:12个卤水肉类中分别检出2-氨基-3-甲基咪唑(IQ)、2-氨基-3,8-二甲基咪唑(MeIQx)、2-氨基-3,4-二甲基咪唑(MeIQ)、9H-pyrido(3,4-b)吲哚(Norharman)和l-甲基-9H-pyrido(Harman)[3,4-b]吲哚(Harman)和2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑(PhIP) [4,5-b]吡啶(2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑(PhIP)。

酱油中挥发性物质目前主要是借助dynamic hesdspace sampling，即动态顶空进样法(DHS)、direct solvent extraction，即直接溶剂萃取法(DSE)、vacuum simultaneous steam distillation-solvent extraction，并利用GCMS技术展开分析，结果显示以上两种品牌香气中的物质成分是根据不同的物质组成的，但是上述3种提取方法中都能够提取出相同的物质成分，由于较高的挥发性香气只能通过dynamic headspace sampling进行提取。

近年来在对样品稀释技术的基础上，构建了一种创新型的嗅觉测试方法，即solid phase microextraction-gas chromatography-olfactometry，利用这种方法能够将酱油中挥发性组分精确鉴别。Kaneko等[9]则是借助aroma extract dilution analysis(AEDA)technique，也就是芳香物质萃取样本稀释的方法，将5种类型的日本酱油中的香气成分以及其中所含的物质含量进行深入的分析，第一次鉴别出2-乙基-1。邻氨基苯乙酮等多种物质成分的具体含量。

Meng Q等将4种日式的酱油进行加热[10]，并将其进行前后的比对，在加热过的酱油中首次发现具有挥发性能的硫醇化合物，还具有2-硫代呋喃甲醇、苯甲硫醇等。以5种日本酱油为原料，经酵母发酵，分别得到2-呋喃甲硫醇(2FM)和2-巯基丙酸乙酯(ET2MP)两种芳香化合物。在酒精发酵过程中，酱油样品中的2FM和ET2MP浓度升高。鲁氏酵母发酵的酱油中2FM和ET2MP的含量高于通用性念珠菌发酵的酱油。采用毛细管柱气相色谱法分离了ET2MP的对映体。酱油中ET2MP对映体的平均对映比约为1∶1。Zhang D等将5种固态发酵的酱油进行分析，通过对游离氨基酸以及其中所包含的具有挥发性能的香气物质展开研究，从实验中能够得出：酱油并不是只具备一种香气，能够通过其中所富含的关键物质来决定酱油的香气[11]。

酱油中挥发性组分、风味是衡量酱油品质的重要指标之一，其气味和口感主要取决于挥发性化合物和氨基酸，因此目前酱油生产都是采用挤压豆粕与面粉混合制成的酱油进行发酵，以提高成品的风味。研究者采用顶空固相微萃取(HS-SPME)和GC-MS相结合的方法对挥发性化合物进行了鉴定，从酱油中鉴别出40多种挥发性化合物，从煮熟的豆粕和面粉混合物中鉴别出24种挥发性化合物，吡嗪及其衍生物占挥发性化合物总含量的1/3，两种样品的氨基酸含量相同。

2 酱油香气成分前后处理方法

国内部分研究学者借助CH2Cl2、无水乙醚、蒸馏萃取等方法来提取酱油中的挥发性香气成分，并通过GC/MS方法来测定其中所蕴含的成分，但是如果只通过单一的处理方法并不能高效地对酱油中具有挥发性的香气成分进行分析[12-15]。高献礼借助固相微萃取方法以及直接溶剂萃取方法来提取物质，并通过气质联用展开鉴定，从中鉴定出近150种具有挥发性的化合物质，但是其中最为主要的挥发性香气成分为酯、醛、酸、醇等[16]。除此之外，还有其他学者对酿造酱油与酸水解酱油进行了对比与分析，并在其中5种酱油中检测出56种具有挥发性的化合物，酱油香气成分的前后处理方法见表2。

表2 酱油挥发性组分分析的前处理方法Table 2 Pretreatment method of volatile components in soy sauce

3 不同酱油的挥发性组成特点

在酱油的品质中，挥发性香气的工艺与原料具有重要的作用，酿造酱油虽然能够拥有相似的指标，但是呈香组分给予每项产品不同的特性，具体见表3。

表3 不同类型酱油香气的成分Table 3 Aroma components of different types of soy sauce

通过实验检测结果可知，7类醇类组分中有5种组分从样品中有效检出，包括乙醇、异戊醇等。具体情况分析如下：稀醪样品中乙醇组分含量较高，这与稀醪样品本身工艺有关，在醇类组分中可以以酵母菌为载体进行代谢，这种反应是在低盐固体工艺中不常见的。酱油酿造的稀醪过程中，在自然环境中耐盐鲁氏酵母占据主要优势，中后期乳酸菌产酸占据优势。乙醇发酵为主要形态，代谢过程中乙醇含量高且呈现不断提高趋势，这一工艺特点也适用于异戊醇中。

自然发酵法的酱油以日晒夜露的方式进行酿造，所以其组分中4-乙基愈创木酚含量较高，究其影响因素主要是暴露在空气中时间长短。苯乙醇作为酵母菌乙醇发酵后的产物，其气味具有一定特殊性，与丁香、茴香等味道融合兼具，稀醪发酵样品中该组分含量较高。低盐固态原油检测样品中，苯乙醇含量相对较高，由于乙醇含量低，从相对层面来看其含量有所增加。究其原因应与酿造实际环境有关，或是与酿造过程中使用毛细管柱性能有关。

不同酿造过程中的样品具有一定的规律性，其中罐装样品中酸类组分含量较高，辛酸、庚酸等含量较高。其中没有发现长链脂肪酸，这和酱油的翻晒方式有直接关联，且受到日晒夜露的工艺影响，其非酶促酯化作用较强。

杨成聪等[17]使用电子鼻和GC-MS技术对市售酱油风味品质进行挥发性组分分析，采用数学方法进行归类分析，生抽与老抽酱油之间出现的挥发性组分差异，前者主要是异丁醇含量较多，而醋酸等含量较少，老抽酱油中芳香族化合物含量远远高于生抽酱油。肖昭竞[18]通过对比不同的前处理萃取方法，使用气-质联用(GC/MS)辨析纯粮酿造酱油和蛋白水解液配制酱油中的挥发性组分，1-辛烯-3-醇是纯粮酿造酱油的标志性物质，而甲基环戊烯醇酮是配制酱油中添加了香精的痕迹，而乙酰丙酸是蛋白水解液的主要指标。

4 总结

综上所述，通过对不同类型的酱油如老抽、生抽、蛋白水解液酱油的挥发性组分进行测定，确定其标志性挥发性组分物质，有利于对酱油的生产、分类、特征型指纹图谱辨析提供依据。若想确保实验最终结果的准确性，还需要选择最佳的处理方法，如利用数学方法进行显著性差异分析等，如魏永义等使用两点检验法应用于不同类型酱油的感官评价中，对酱油的鲜味、酯香、甜味、色泽、酱香等多个指标进行多重检验，确定了一套较好的方法。酱油中蕴含丰富的物质种类，例如醇、酚、醛、酮、有机酸等，由于其中所含的物质成分含量较低，致使热力学变化与单体分子动态存在一定的平衡。因此，要选择合适的方法将这些挥发性物质进行有机的分离，并对各个物质的详细参数进行优化，才能准确地辨析不同类型酱油的特征。