固定化红曲酯化酶处理新醋提高其品质的研究

张媛渊，王如福，郎繁繁，侯红萍*

(1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 晋中 030801； 2.山西紫林醋业股份有限公司，太原 030400)

早在20世纪50年代就有了固定化酶技术，即用固体材料将酶束缚或限制在一定的空间内，但其仍能进行特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术，相比传统的游离酶更有优势，稳定性好，易与底物及反应物分离，可维持酶活力等[1，2]。固定化酶技术被广泛应用于食品、制药、生物和化学分析、环境保护等各个领域[3-8]。载体材料的选择对制备固定化酶尤为重要，选择某种惰性材料，对酸、碱、温度等环境条件具有一定的耐受性。

山西老陈醋有颜色较深、醋液清亮、气香醇厚等特点，传统的山西老陈醋经过“夏日晒，冬捞冰”的方法进行陈酿，时间长达9～12个月，可制得老陈醋，传统陈酿方法有较多的缺点，如：占地面积广，不易管理，环境不佳等，所以人工催陈食醋技术备受关注，主要有物理法和化学法[9-11]。而生物酶法在醋中的应用尚未可见，利用酶加速催化醋的陈化是新的研究方向。

本试验采用包埋法固定化红曲酯化酶，将其应用于食醋中，促进酯化反应，提高品质。对食醋企业的发展有提升经济效益的作用，有广阔的应用前景。

1 材料和方法

1.1 原料和试剂

原料：山西紫林醋业股份有限公司。

红曲酯化酶(食品级，10万/活力单位)：武汉佳成生物制品有限公司；食品级黄原胶(XG)、食品级瓜尔豆胶(GG)、食品级卡拉胶(CG)、食品级海藻酸钠(SA)、α-萘酚、α-乙酸萘酯、SDS、无水碳酸钠、固蓝B盐。

1.2 仪器和设备

ST3100实验室pH计 奥豪斯仪器有限公司；UV-1800PC型紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；JJ124BC型万分之一电子天平 常熟市双杰测试仪器厂；B11-3型恒温磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司；HHS型电热恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酯化酶酶液制备

称取1 g酶粉，用pH 3.6的乙酸-乙酸钠缓冲溶液充分溶解，将酶液用100 mL容量瓶定容。再用定性滤纸将其过滤，得到酯化酶酶液，置于4 ℃冰箱中冷藏[12]。

1.3.2 游离酯化酶活力测定

图1 α-萘酚标准曲线Fig.1 Standard curve of α-naphthol

参考文献[13，14]的方法改进：移取 0.25 mL酯化酶液, 加入磷酸缓冲液 4.25 mL，然后加入0.25 mL 0.1 mg/mL α-乙酸萘酯溶液, 于40 ℃恒温水浴定时反应10 min, 然后加入 0.25 mL 3% SDS水溶液终止反应, 再加入0.25 mL 0.05%的固蓝B盐溶液显色，混匀计时 30 s时加入 0.25 mL 6 mol/L的盐酸溶液使显色稳定, 同时把酶液换成蒸馏水的溶液作空白, 用分光光度计检测并记录数据。

用紫外分光光度计扫描α-萘酚以及固蓝B盐与 α-萘酚形成络合物的吸收曲线，在525 nm处有最大吸收峰，选择 525 nm为最佳测定波长。绘制α-萘酚标准曲线，见图1。

1.3.3 固定化酯化酶活力的测定

准确称取一定质量的固定化酶颗粒，根据游离酯化酶活力的测定方法测定固定化酯化酶的活力。

1.3.4 相对酶活力的计算

相对酶活是按同组最高酶活为参考，计算出的酶活比值为相对酶活，设定同组最高酶活力的相对酶活，计为100%。

1.3.5 固定化酯化酶的制备

载体材料：海藻酸钠(SA)、黄原胶(XG)、瓜尔豆胶(GG)、卡拉胶(CG)。

载体浓度：以载体溶液总体积30 mL 计，设定复合凝胶质量浓度为0.9，1.2，1.5，1.8，2.1，2.4 g/dL，载体比例1∶1或1∶1∶1 ，称取胶体，在 60 ℃ 以下温水溶解，室温下加入6 mL 酯化酶液，搅拌均匀，放入40 ℃恒温水浴锅内至胶体中无残留的气泡。 使用 10 mL无菌注射器，以约1 滴/s的速度，将凝胶滴入质量浓度为2.4%的CaCl2溶液中，在 4 ℃ 冰箱中固化 2.0 h之后将载体颗粒滤出，再用乙酸-乙酸钠缓冲液冲洗除去表面的CaCl2溶液。擦干载体颗粒表面的水分， 得到固定化酶颗粒，在0～4 ℃ 下保存备用。

在此基础上，采用单因素轮换法，依次考察载体比例3∶2(3∶1∶1)、2∶1(4∶1∶1)、5∶2(5∶1∶1)、3∶1(6∶1∶1)，固定化时间(1.5，2，2.5，3，3.5，4 h)、固定化液浓度(1.8%、2.4%、3%、3.6%、4.2%、4.8%)和酶液添加量(3，4，5，6，7，8 mL)测定相对酶活力。

1.3.6 固定化酯化酶条件的响应面优化试验

在单因素试验的基础上，根据响应面Box-Benhnken的中心组合设计原理，以固定化载体浓度(X1)、固定时间(X2)、酶液添加量(X3)为影响因素，相对酶活力(Y)为响应值进行响应面优化，试验因素与水平见表1。

表1 试验因素与水平Table 1 Factors and levels of test

1.3.7 固定化酯化酶操作半衰期的研究

取一定量的固定化酶测定初始酶活力，以乙酸乙酯为底物进行反应，做2组重复，每隔2天测定1次。假定活力损失与时间成指数关系， 半衰期用下式表达：

式中：E为反应初始时的酶活U;Et为反应t时刻的酶活U。

1.3.8 食醋主要理化指标的测定

总酸的测定参考GB/T 5009.41—2003《食醋卫生标准的分析方法》；氨基酸态氮的测定参考GB/T 5009.39—2003《酱油卫生标准的分析方法》；不挥发酸的测定参考GB/T 18187—2000《酿造食醋》；还原糖的测定参考GB/T 19777—2013《地理标志产品 山西老陈醋》；总酯的测定参考GB/T 19777—2013《地理标志产品 山西老陈醋》。

1.3.9 固定化酯化酶应用于食醋

将制备好的固定化酶颗粒加入100 mL食醋中促进其酯化反应。固定化酯化酶的添加量为6，9，12 g；控制作用温度分别为35，40，45 ℃；分别测定在12，24，36，48 h的总酯含量。并根据响应面法优化试验确定加入最佳固定化酶量、作用时间及作用温度。

2 结果与分析

2.1 固定化酯化酶条件的确定

2.1.1 载体的浓度对固定化酯化酶相对酶活力的影响

载体浓度对固定化酯化酶相对酶活力的影响结果见图2。

图2 载体的浓度对固定化酯化酶活力的影响Fig.2 Effect of carrier concentration on activity of immobilized esterase

由图2可知，SA-XG-CG和SA-XG随着载体浓度的增加，相对酶活力逐渐增加，当浓度达到2.1 g/dL时相对酶活达到最大值，分别为99.86%和94.14%，当浓度>2.1 g/dL时，相对酶活力逐渐下降；SA-CG、SA-GG、SA-XG-GG、SA-CG-GG随着载体浓度的增加，相对酶活力也逐渐增加，当浓度达到1.8 g/dL时相对酶活达到最大值，分别为88.92%、95.91%、95.48%、93.01%。故选择SA-XG和SA-XG-CG的最佳载体浓度为2.1 g/dL；SA-CG、SA-GG、SA-XG-GG、SA-CG-GG的最佳载体浓度为1.8 g/dL。

2.1.2 载体比例对固定化酯化酶相对酶活力的影响

载体比例对固定化酯化酶相对酶活力的影响见表2。

表2 载体比例对固定化酯化酶活力的影响Table 2 Effect of carrier ratio on activity of immobilized esterase

由表2可知，当SA-XG、SA-CG、SA-GG、SA-XG-CG、SA-XG-GG、SA-CG-GG的载体比例分别为3∶1、5∶2、3∶1、4∶1∶1、4∶1∶1、5∶1∶1时，相对酶活力较高，分别为74.56%、100%、82.88%、79.37%、86.17%、90.15%。因此选择3种酶活力较高的载体组合为SA-CG、SA-XG-GG、SA-CG-GG，且比例分别为5∶2、4∶1∶1、5∶1∶1。

2.1.3 固定化时间对固定化酯化酶相对酶活力的影响

固定化时间对固定化酯化酶相对酶活力的影响见图3。

图3 固定化时间对固定化酯化酶活力的影响Fig.3 Effect of immobilization time on activity of immobilized esterase

由图3可知，随着固定化时间的增加，相对酶活力逐渐增加，SA-CG在2.5 h达到最大值94.24%，当时间>2.5 h时，相对酶活力呈下降趋势；SA-XG-GG与SA-CG-GG在3 h达到最大值99.56%和85.44%；当时间>3 h时，相对酶活力呈下降趋势。因此选择SA-CG、SA-XG-GG、SA-CG-GG的最佳固定化时间分别为2.5，3，3 h。

2.1.4 固化液浓度对固定化酯化酶相对酶活力的影响

固化液浓度对固定化酯化酶相对酶活力的影响见图4。

图4 固化液浓度对固定化酯化酶活力的影响Fig.4 Effect of solidified liquid concentration on activity of immobilized esterase

由图4可知，随着固定化时间的增加，相对酶活力先增加后减小，SA-CG在2.4 g/dL达到最大值99.87%，当浓度>2.4 g/dL时，相对酶活力呈下降趋势；SA-XG-GG与SA-CG-GG在3 g/dL达到最大值98.98%和95.78%；当浓度>3 g/dL时，相对酶活力呈下降趋势。因此选择SA-CG、SA-XG-GG、SA-CG-GG的最佳固定化浓度分别为2.4，3，3 g/dL。

2.1.5 酶液添加量对固定化酯化酶相对酶活力的影响

酶液添加量对固定化酯化酶相对酶活力的影响见图5。

图5 酶液添加量对固定化酯化酶活力的影响Fig.5 Effect of the additive amount of enzyme solution on activity of immobilized esterase

由图5可知，随着固定化时间的增加，相对酶活力先增加后减小，SA-CG、SA-XG-GG、SA-CG-GG在酶液添加量为7 mL达到最大值99.65%、90.96%、92.96%；当酶添加量>7 mL时，相对酶活力呈下降趋势；因此选择最佳酶液添加量为7 mL。

综合比较分析得出选择SA-CG为最佳固定化酯化酶载体，载体比例为5∶2，载体浓度为1.8 g/dL，固定化时间为2.5 h，固化液浓度为2.4 g/dL，酶液添加量为7 mL。

2.2 固定化酯化酶响应面优化试验结果

2.2.1 响应面试验设计及试验结果

响应面试验设计及结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 试验设计及结果Table 3 Design and results of test

注：“*”表示差异显著(P<0.05)；“**”表示差异极显著(P<0.01)。

根据响应面试验结果得出：固定化酯化酶相对酶活力(Y)与载体浓度(X1)、固定化时间(X2)、酶液添加量(X3)3个因素的多元线性回归模型方程为：Y=99.04-2.77X1+0.33X2+4.16X3-2.30X1X2-1.87X1X3+1.33X2X3-8.16X12-8.83X22-10.16X32。

由表4可知，模型的P<0.0001，差异极显著，试验设计可靠；失拟项P=0.0564>0.05，差异不显著，则回归方程的拟合程度良好，可反映3个因素与响应值的关系；且模型回归决定系数R2=0.9875，则响应值的变化有98.75%来源于所选因素的变化，该模型可用来预测酯化酶固定化条件的优化程度。回归方差及各项方差结果表明，3个因素固定化酯化酶相对酶活力的影响主次顺序为X3>X1>X2，即酶液添加量>载体浓度>固定化时间。另外，一次项X1和X3对Y影响极显著(P<0.01)；交互项X1X2对Y影响显著(P<0.05)。

由Design-Expert 8.0.6.1得出固定化酯化酶的最优条件：载体浓度为1.68 g/dL，固定化时间为2.56 h、酶液添加量7.23 mL，其相对酶活力达到99.81%。为了便于实际操作，将最优工艺条件修订为：载体浓度1.68 g/dL、固定化时间153 min、酶液添加量7.23 mL。

2.2.2 固定化酯化酶条件的响应面分析及等高线

载体浓度、固定化时间、酶液添加量交互作用对固定化酯化酶相对酶活力影响的响应面曲线及等高线见图6。

图6 载体浓度、固化时间、酶液添加量交互作用对固定化 酯化酶相对酶活力影响的响应面曲线及等高线Fig.6 Response surface and contour map of effects of carrier concentration, immobilization time and the additive amount of enzyme solution on relative activity of immobilized esterase

由图6可知，任何2个交互作用的响应面都存在最高点，可直观得到各因素的最优水平及其相互作用。

2.2.3 验证试验

为验证上述结果的可靠性，在此最优条件下做3次平行试验，得到的固定化酯化酶的相对酶活力为(99.79±0.158)%，与预测值99.81%一致，故得到的模型能够较好预测实际固定化酯化酶的相对酶活力，具有可靠的现实意义。

2.3 固定化酶操作半衰期

准确称取一定质量固定化酶测定初始酶活力值，并准确称取等质量的固定化酶颗粒加入食醋中进行催陈，做2组重复，2天后取出，计算该固定化酯化酶的操作半衰期，结果为70.7 h 。

2.4 固定化酯化酶应用于食醋的催陈作用

固定化酯化酶作用于食醋的催陈作用见图7～图9。

图7 在35 ℃条件下固定化酯化酶应用于食醋的 作用时间对食醋的催陈效果Fig.7 Effect of time of immobilized esterase applied to vinegar on vinegar aging at 35 ℃

图8 在40 ℃条件下固定化酯化酶应用于 食醋的作用时间对食醋的催陈效果Fig.8 Effect of time of immobilized esterase applied to vinegar on vinegar aging at 40 ℃

图9 在45 ℃条件下固定化酯化酶应用于 食醋的作用时间对食醋的催陈效果Fig.9 Effect of time of immobilized esterase applied to vinegar on vinegar aging at 45 ℃

由图7～图9可知，当固定化酯化酶添加量为9 g时，作用时间达到24 h时总酯含量都达到了最大值，在35，40，45 ℃下总酯含量分别为12.6，12.87，12.76 g/L，当时间>24 h 时总酯含量缓慢较低，可能是酯化发生了逆反应。综合比较分析得出：在温度为40 ℃下，固定化酯化酶添加量为9 g时，处理24 h对食醋的催陈作用效果最佳。

固定化酯化酶作用醋的前后理化指标的比较见表5，处理后食醋中氨基酸态氮含量增加，总酯含量达到12.87 g/L，相对于原醋的9.73 g/L提高了32.31%。

表5 固定化酯化酶作用醋的前后理化指标的比较Table 5 Comparison of physicochemical indexes of immobilized esterase applied to vinegar before and after treatment g/dL

3 结论

采用食品级卡拉胶与食品级海藻酸钠复合凝胶制作的固定化酯化酶对新醋进行催陈，通过响应面法优化得到固定化酯化酶的最优工艺条件：固定化载体的浓度为1.68 g/dL，载体比例为5∶2，固定化时间为153 min，固化液浓度为2.4 g/dL、酶液添加量7.23 mL。在最优工艺条件下，固定化酯化酶相对酶活力可达到99.79%；固定化酯化酶催陈食醋的条件为：酶添加量为9 g/dL，处理时间为24 h，处理温度为40 ℃，总酯含量可达到12.87 g/L，比新醋提高了32.31%，且口感较好，醋香柔和，酯味醇厚，对改善传统食醋的陈酿方法有一定的借鉴意义，对食醋企业的发展有提升经济效益的作用，应用前景广阔。