低糖腌制韭菜根中优势腐败菌的分离与鉴定

胡秀虹，张廷辉，李建会，李培,3，王翔,3*

(1.凯里学院 大健康学院，贵州 凯里 556011；2.黔东南州食品药品检验检测中心， 贵州 凯里 556011；3.黔东南民族药综合利用工程技术研究中心，贵州 凯里 556011)

腌韭菜根是用宽叶韭(AlliumhookeriThwaites)的肉质根拌以盐、糖等辅料加工制成的产品。宽叶韭又称大叶韭，百合科葱属多年生宿根性植物，是以根茎为主要食用部位的韭菜，原产于云、贵、川和西藏[1,2]。贵州黔东南麻江县“坝芒”牌腌韭菜根是以糖粉、辣椒面等为辅料，在无任何防腐剂、色素添加下，经传统的腌制工艺加工而成，其营养价值丰富，具有特殊的辛香味，是一款本土特色食品[3]。

目前，腌韭菜根的生产还处于作坊式加工状态，生产环境条件差、生产技术相对落后且缺乏相应的操作规范，故在加工生产中，往往易造成产品质量不统一、货架期短等问题。袋装腌韭菜根，由于是低糖腌制，又不加任何防腐剂，在贮、运、销过程中易被微生物污染，发生胀袋变质。故本研究以胀袋变质的真空包装韭菜根为原料，从中分离筛选出优势腐败菌，通过形态学特征、生理生化试验和16S rRNA基因序列分析鉴定出引起真空包装韭菜根胀袋变质的主要微生物，以期为腌韭菜根的生产工艺及微生物污染的有效控制提供一定的理论指导。

1 材料与方法

1.1 实验材料

低糖腌制韭菜根：由贵州麻江裕沃生态农业发展有限公司提供；营养琼脂培养基、营养肉汤培养基：均购于北京奥博星生物技术有限责任公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、PCR扩增引物：购于上海生工生物工程股份有限公司；生理生化试剂：均购于天津市大茂化学试剂厂。

1.2 实验方法

1.2.1 实验原材料检测

以胀袋变质的低糖腌制韭菜根为供试样品，参照GB 10468—89，采用酸度计测定样品pH；参照GB/T 12456—2008，采用酸碱滴定法测定样品总酸度；参照GB 5009.8—2016，采用酸水解法测定样品总糖含量；参照GB 2714—2015进行样品感官检查。

1.2.2 腐败菌的菌落分离纯化

选取真空包装后出现腐败变质的低糖腌制韭菜根，在无菌操作下，称取25 g，剪碎，放入装有225 mL无菌生理盐水的灭菌均质袋中，均质器拍击均质5 min(拍击速度为8次/s)，制成样品匀液，梯度稀释至适宜浓度，吸取0.1 mL于营养琼脂培养基上涂布均匀，37 ℃培养24 h，从中挑取典型单菌落并反复进行平板划线分离，得到纯化的单菌落菌株，编号并保存。

1.2.3 优势腐败菌的筛选

将分离纯化得到的各菌株平板活化12 h，挑起菌体用无菌水制成菌悬液，使菌体浓度约为105～106cfu/mL。将灭菌后的韭菜根浸于菌悬液中，5 s后取出晾干，置于无菌袋中真空包装，以未接腐败菌的韭菜根作对照，37 ℃恒温保存。从是否发生胀袋及韭菜根感官变化方面进行比较，以使韭菜根样品较快腐败的接种菌株作为优势腐败菌。

1.2.4 优势腐败菌的鉴定

采用平板涂布法将各菌株分别接种至营养琼脂培养基中，37 ℃培养18～24 h后观察菌落形态，参照《微生物学实验教程》进行革兰氏染色和芽孢染色[4]，参照文献[5]制备细菌扫描电镜样品，观察菌体形态，参照《常见细菌系统鉴定手册》进行生理生化特性试验[6]。将各菌株分别接种于肉汤培养基中，37 ℃振荡培养至对数期，8000 r/min离心收集菌体。按照细菌基因组DNA提取试剂盒方法分离纯化菌株基因组DNA。根据原核生物16S rRNA保守序列通用引物：27F (5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和1492r(5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)，以各菌株的基因组DNA为模板，对该菌株的16S rDNA进行PCR扩增。扩增反应体系(25 μL)：基因组DNA 0.5 μL，10×buffer(with Mg2+) 2.5 μL，引物(20 pmol/μL)各0.5 μL，Tras DNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，加双蒸H2O至25 μL，反应条件为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析后，送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序，测序结果按文献[7]方法进行分析，构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 实验原材料检测

以不发生腐败变质的腌韭菜根为对照，对胀袋变质的腌韭菜根(见图1)进行总酸、总糖及感官分析检测，结果见表1。

图1 腌韭菜根胀袋变质前后对比Fig.1 Comparison of pickled Chinese chives roots before and after bag bulging and deterioration

组别pH总酸(g/100 g)总糖(g/100 g)感官分析对照组6.28～6.440.12～0.1833.06～33.15正常色泽(淡黄色)、辛香气味、葱辣味浓、有韧性、饱满胀袋组4.53～4.670.19～0.2735.23～35.28色泽暗,黑褐色、刺鼻酸败味、葱辣味淡、软焉、不饱满

由表1可知，真空包装低糖腌制韭菜根在流通贮藏期间，发生胀袋变质的腌韭菜根酸度、总糖含量均下降，产品的外观色泽、辛香气味、质感及口感均发生明显变化。

2.2 优势腐败菌的分离筛选

将腐败变质的低糖腌制韭菜根均质液通过稀释涂布及划线法分离得到17株单菌落，经纯化制成菌液，接种至无菌韭菜根中进行致腐实验，通过胀袋及感官评定比较，发现接种菌株XB3、XB5、XB7、XB8的韭菜根样品腐败较快。将这些致腐能力较强的菌株作为优势菌，进一步研究其形态学特性、生理生化特性及种属关系。

2.3 优势腐败菌的鉴定

2.3.1 优势腐败菌的形态及生理生化鉴定

各菌株的扫描电镜结果见图2，图2中的A，B，C，D分别表示菌株XB3、XB5、XB7、XB8。

由图2可知，XB3菌体呈杆状，末端钝圆，菌体表面光滑、无鞭毛、无纤毛，产芽孢；XB5菌体呈短杆状，末端钝圆，菌体表面光滑、无鞭毛、无纤毛，产芽孢；XB7菌体呈杆状或近球状，菌体表面光滑、无鞭毛、无纤毛，产芽孢；XB8菌体呈长杆状，菌体表面光滑有内陷、无鞭毛、无纤毛，产芽孢。

图2 腐败菌的扫描电镜照片Fig.2 Scanning electron microsgroph of spoilage bacteria

各株腐败菌的部分形态学特征和生理生化试验结果分别见表2和表3。

表2 腐败菌的形态学特征Table 2 Morphology characteristics of spoilage bacteria

注：“+”表示有；“-”表示没有。

表3 腐败菌的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of spoilage bacteria

注：++表示产酸产气；+-表示产酸不产气；-+表示不产酸产气；--表示不产酸不产气；+表示阳性反应；—表示阴性反应；(+)表示弱阳性反应；(—)表示弱阴性反应。

由表2可知，4株腐败菌的菌落形态具有明显差异，均属于产芽孢杆菌，除XB7外，其余3株菌革兰氏阳性。由表3可知，所有腐败菌株接触酶反应阳性，表明其能产生过氧化氢酶；XB5能液化明胶，表明该菌株具有较强的水解蛋白质的能力；XB3、XB5和XB7表现出甲基红反应阳性，表明这些菌株可发酵葡萄糖产酸；XB3在葡萄糖、蔗糖发酵中产酸不产气；XB5在葡萄糖发酵中产酸不产气，但在蔗糖、乳糖发酵中产酸产气；XB7在蔗糖发酵中产酸产气；XB8在葡萄糖发酵中不产酸不产气，在蔗糖、乳糖发酵中产酸不产气。分析结果表明，具有产气能力的菌株可能是引起韭菜根产品胀袋的主要腐败菌，产酸菌株可能是导致韭菜根酸败异味的主要腐败菌，产酶菌株可能会导致韭菜根软化。

2.3.2 基于16S rRNA基因序列的系统发育分析和分子鉴定

以菌株的总DNA为模板，用细菌16S rRNA序列通用引物进行PCR扩增，其产物电泳结果见图3。

图3 腐败菌的16S rRNA PCR产物电泳图Fig.3 Electrophoresis of 16S rRNA PCR products of spoilage bacteria

1，2，3，4泳道分别表示菌株XB3、XB5、XB7和XB8的16S rRNA基因的PCR扩增产物；MK为DNA Marker。由图3可知，其序列长度大约在1500 bp。经测序，菌株XB3、XB5、XB7和XB8的序列长度分别为1504，1515，1481，1497 bp，均符合细菌16S rRNA序列长度。将其与数据库中同源性较高的模式菌株进行比较，构建系统发育进化树，结果见图4。由图4可知，菌株XB3与Bacilluscereus亲缘关系最近，菌株XB5与Bacillusmegaterium亲缘关系最近，菌株XB7与Acinetobacterlactucae亲缘关系最近，菌株XB8与Paenibacillusamylolyticus亲缘关系最近，相似度均大于99%。因此，由分子生物学鉴定结果结合菌落形态特征及生理生化特性可判定，从腐败韭菜根中分离的腐败细菌XB3为B.cereus，XB5为B.megaterium，XB7为A.lactucae,XB8为P.amylolyticus。

图4 基于16S rRNA基因序列同源性的4株腐败菌系统发育树Fig.4 Phylogenetic trees of four spoilage bacteria based on 16S rRNA sequence homology

3 结论

微生物生长繁殖是导致真空包装腌韭菜根胀袋变质的主要原因，胀袋的韭菜根无论是酸度、总糖还是色泽、气味、口感等感官品质均大大下降。本研究从发生胀袋变质的低糖腌制韭菜根中分离筛选到4株优势腐败细菌，经鉴定，主要由B.cereus，B.megaterium，A.lactucae和P.amylolyticus构成。芽孢杆菌是胀袋变质腌韭菜根中的主要腐败菌属，其中B.megaterium和A.lactucae可能是引起韭菜根胀袋的主要腐败菌株，B.megaterium，B.cereus，P.amylolyticus和A.lactucae在一定程度上均能导致韭菜根产生酸败异味、发黑、软化等变质现象。该研究有望为解决贵州黔东南州本土特色食品——腌韭菜根在生产和贮藏过程中出现的胀袋变质问题提供参考，也为下一步天然防腐剂的筛选应用及灭菌工艺的优化奠定基础。