相溶解度法研究环糊精对山奈酚的增溶作用

陆兰芳，杨鹏，王展，汪卓琳，于博*

(1.湖北文理学院 食品科学技术学院，湖北 襄阳 441053; 2.武汉轻工大学 食品科学与工程学院，武汉 430023)

山奈酚(kaempferol)是一种黄酮类化合物，几乎不溶于水，来源于姜科植物山奈的根、茎以及檀香科植物百蕊草的提取物。山奈酚具有抗氧化、抗炎、抗癌、防治糖尿病、动脉粥样硬化和骨质疏松、保护神经、肝脏和心肌以及抑制蛋白激酶活性等营养保健功能[1-5]，在食品、药品等领域有着非常广阔的应用前景；但是山奈酚几乎不溶于水，这极大地限制了其应用范围。环糊精分子具有刚性锥形空腔结构，外部亲水、内部疏水，能包合疏水性客体分子，起到提高溶解度和稳定性的作用，基于主客体相互作用的环糊精分子微胶囊是一种提高疏水性生物活性分子溶解性和稳定的可靠技术手段。采用相溶解度法，能够研究难溶性客体分子在环糊精存在下的溶解度变化规律，并计算其稳定常数，这在环糊精微胶囊领域研究日益广泛[6-12]。本文采用相溶解度法系统地研究了常用的环糊精对山奈酚的包合作用、增溶作用以及包合过程中有关热力学参数的变化规律，以期为山奈酚的微胶囊化应用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

α-环糊精(α-CD)、β-环糊精(β-CD)、γ-环糊精(γ-CD)、甲基-β-环糊精(M-β-CD)、2-羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)、麦芽糖基-β-环糊精(Mal-β-CD) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；山奈酚、磺丁基-β-环糊精(SBE-β-CD)、羟乙基-β-环糊精(HE-β-CD) 上海源叶生物科技有限公司；甲醇(分析纯) 西陇科学股份有限公司。

AL204电子分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；UV-2600PC紫外可见光分光光度计 岛津企业管理(中国)有限公司；QYC-200全温培养摇床 上海新苗医疗器械制造有限公司；PGJ-10-AS(超)纯水机 武汉品冠仪器设备有限公司；KQ-500E型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 山奈酚的标准曲线

准确称取0.0286 g的山奈酚，用无水乙醇溶解并转移至100 mL棕色容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，配得0.001 mol/L山奈酚母液，转移至棕色试剂瓶置于冰箱中保存备用。分别吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL的0.001 mol/L的山奈酚母液于7个10 mL的棕色离心管中，用无水乙醇定容至刻度，配得1.0×10-5～7.0×10-5mol/L一系列浓度梯度的山奈酚溶液，以无水乙醇作为空白对照，在波长367 nm处测定不同浓度山奈酚溶液的吸光度。以山奈酚的浓度为横坐标，各浓度下的吸光度为纵坐标，绘制山奈酚的标准曲线。

1.2.2 不同环糊精浓度下的山奈酚增溶试验

准确称取适量不同环糊精，用超纯水溶解，混合均匀，分别配得0.01 mol/L的环糊精水溶液各100 mL。吸取浓度为0.01 mol/L的环糊精水溶液0，2，4，6，8，10 mL于6个棕色玻璃瓶中，然后分别加入10，8，6，4，2，0 mL超纯水，配成10 mL浓度分别为0×10-3，2×10-3，4×10-3，6×10-3，8×10-3，10×10-3mol/L的环糊精溶液[13]。均加入过量的山奈酚，超声10 min，再置于摇床中，设置转速为120 r/min，温度分别为25，37，45 ℃，时间为72 h，振摇结束后静置，待溶液达到平衡，用0.45 μm的滤膜过滤，取滤液1 mL于10 mL的棕色离心管中，超纯水定容，在波长367 nm测定不同浓度环糊精下山奈酚的吸光度[14,15]。根据标准曲线求出相应环糊精浓度下山奈酚的溶解度，以环糊精浓度为横坐标，山奈酚的溶解度为纵坐标，绘制相溶解度曲线。判定线型关系，并计算包合常数和热力学参数。

1.2.3 环糊精/山奈酚包合过程的热力学计算

山奈酚与不同环糊精在不同温度(25，37，45 ℃)下的包合常数K，结合Van's Hoff方程可得：

△G=-RTlnK。

(1)

△G=△H-T△S。

(2)

可计算热力学参数△G。由方程(1)和(2)可得：

(3)

以lnK对1/T作线性回归，根据直线的斜率和截距计算热力学参数△H和△S[16,17]。

2 结果与讨论

2.1 山奈酚的标准曲线

山奈酚的标准曲线，见图1。

图1 山奈酚的标准曲线Fig.1 Standard curve of kaempferol

由图1可知,回归方程为y=0.1952x-0.0115，R2=0.9986，表明浓度在0～7.0×10-5mol/L范围内山奈酚的浓度与吸光度线性关系良好。

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2.2 山奈酚的相溶解度曲线

按1.2.2的方法计算不同温度下不同浓度环糊精溶液中的山奈酚含量，通过山奈酚与环糊精浓度的对应关系，选择合适的横纵坐标，绘制山奈酚在25，37，45 ℃条件下的相溶解度曲线，结果见图2～图4。

图2 25 ℃时环糊精对山奈酚溶解度的影响Fig.2 Effect of cyclodextrin on the solubility of kaempferol at 25 ℃

图3 37 ℃时环糊精对山奈酚溶解度的影响Fig.3 Effect of cyclodextrin on the solubility of kaempferol at 37 ℃

图4 45 ℃时环糊精对山奈酚溶解度的影响Fig.4 Effect of cyclodextrin on the solubility of kaempferol at 45 ℃

由图2～图4可知，同一温度下山奈酚的浓度随着环糊精浓度的增加呈现良好的线性关系，相溶解度曲线为AL型，说明环糊精与山奈酚形成了1∶1的包合物。随着环糊精浓度的依次增大，山奈酚的溶解度逐次递增，在25，37，45 ℃下，SBE-β-CD、HE-β-CD、M-β-CD、HP-β-CD所在线段的斜率很高，说明对山奈酚增溶效应较为明显，γ-CD、β-CD、Mal-β-CD、α-CD斜率则很小且相溶解度曲线很接近。增溶效果的顺序为SBE-β-CD>HE-β-CD>M-β-CD>HP-β-CD>γ-CD>β-CD>Mal-β-CD>α-CD。

2.3 环糊精/山奈酚包合常数的计算

包合稳定常数是衡量包合物稳定性的重要参数，它反映了环糊精与药物分子形成包合物时结合力的强弱，K值越大，包合效果越好，包合常数K值理论上只有AL型的溶解等温线才可求出，而AN型计算较困难，一般将曲线开始的直线部分进行线性回归。

包合稳定常数K=斜率/[ So×(1-斜率)]。

式中：斜率为相溶解度曲线的斜率；So为山奈酚在各温度下水中的饱和溶解度[18,19]。

表1 环糊精对山奈酚的线性回归方程 及包合常数KTable 1 Linear regression equation and inclusion constant K of cyclodextrin to kaempferol

由表1可知，在不同温度下，8种环糊精对山奈酚的增溶都呈现出较好的线性关系，随着温度的升高，α-CD、β-CD、γ-CD、M-β-CD、SBE-β-CD、HE-β-CD、HP-β-CD对山奈酚的包合常数逐渐增大，说明升高温度有利于这7种环糊精与山奈酚包合平衡；而Mal-β-CD对山奈酚的包合常数随着温度的升高而减小，说明升高温度，不利于包合平衡。在同一温度下，8种环糊精对山奈酚的包合常数的大小顺序SBE-β-CD>HE-β-CD>M-β-CD>HP-β-CD>γ-CD>β-CD>Mal-β-CD>α-CD，这可能与各种环糊精不同的空间结构有关。SBE-β-CD对山奈酚的包合常数最大，在45 ℃时达到19082.1 mol/L，这是由于SBE-β-CD有带负电荷的磺丁基，其基团比-OH有更强的亲水性，在水中的溶解度很好，能够包合山奈酚并极大地提高其在水中的溶解度。

2.4 环糊精/山奈酚包合过程的热力学计算

山奈酚与环糊精包合过程的热力学参数见表2。

表2 山奈酚与环糊精包合过程的热力学参数Table 2 Thermodynamic parameters of inclusion process of kaempferol and cyclodextrin

由表2可知，环糊精在不同温度下与山奈酚包合的吉布斯自由能变化△G<0，表明环糊精与山奈酚的包合自发进行，随温度升高，其负值逐渐增大，说明高温使包合的自发倾向增大；△H>0，表明环糊精与山奈酚的包合反应为吸热反应，升高温度有利于包合反应， Mal-β-CD与山奈酚包合的△H<0，说明此包合反应为放热反应，升高温度不利于包合的进行；△S>0，表明环糊精与山奈酚的包合反应为熵增反应，根据热力学第二定律，疏水作用在包合过程中起主要作用。

2.5 不同环糊精对山奈酚增溶效应分析

根据相溶解度的方法，测定不同温度下山奈酚在8种环糊精的5个浓度中的溶解度和山奈酚在不同温度下水中的饱和溶解度，分析环糊精对山奈酚的增溶效应(S/So)，其中S/So为增溶因子，表示各种环糊精对山奈酚的增溶作用；S为山奈酚在各种环糊精中的浓度；So为山奈酚在水中的饱和溶解度[14]。山奈酚在25，37，45 ℃的水中的溶解度分别为7.0×10-5，8.0×10-5，9.0×10-5mol/L，不同浓度的环糊精对山奈酚的增溶效果见表3。

表3 环糊精对山奈酚的增溶效应Table 3 Solubilization effect of cyclodextrin on kaempferol

由表3可知，环糊精对山奈酚的增溶效果随着环糊精浓度的增大而呈现递增的趋势。同一种环糊精，随着温度的增加，环糊精对山奈酚的增溶效果增加。不同的环糊精对山奈酚的增溶效果差异显著，α-CD、β-CD、γ-CD对山奈酚的增溶作用很小，而SBE-β-CD对山奈酚的增溶作用极其显著，SBE-β-CD的浓度在1×10-2mol/L、温度为45 ℃时，其对山奈酚的增溶因子高达70.03，增溶效应顺序为SBE-β-CD>HE-β-CD>M-β-CD>HP-β-CD>γ-CD>β-CD>Mal-β-CD>α-CD。

3 结论

采用相溶解度法系统地研究了8种环糊精对山奈酚的增溶作用及包合过程中的热力学参数，初步揭示了环糊精包合山奈酚的热力学规律。研究表明山奈酚的溶解度随着8种环糊精浓度的增加而呈线性递增的趋势，相溶解度曲线为AL型，环糊精与山奈酚形成的包合物类型为1∶1型，增溶效应与环糊精浓度和温度呈正相关，增溶效应顺序为SBE-β-CD>HE-β-CD>M-β-CD>HP-β-CD>γ-CD>β-CD>Mal-β-CD>α-CD，α-CD的增溶效应极小，而SBE-β-CD、HE-β-CD、M-β-CD、HP-β-CD的增溶效应明显。吉布斯自由能变化△G<0，包合过程为自发进行；Mal-β-CD与山奈酚的焓变△H<0，此包合过程为放热反应，其他7种环糊精与山奈酚的△H>0，说明此包合过程为吸热反应，升高温度有利于包合的进行；熵变△S>0，包合过程熵增。因此，可以根据山奈酚的应用领域，选择SBE-β-CD、HE-β-CD、M-β-CD、HP-β-CD包合山奈酚，提高山奈酚的溶解度，拓展山奈酚的应用范围。