基于QuEChERS-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定酱油类调味品中的氨基甲酸乙酯

黄秋婷，王成龙，王宇,2，戚平，宋安华*

(1.广州市食品检验所，广州 510410；2.广东美味鲜调味食品有限公司，广东 中山 528437)

酱油是中国家庭必不可少的调味料，在日常烹饪中需求量大。但在其生产工艺，豆制品发酵过程中，尿素或瓜氨酸会与乙醇反应，产生一种2A类致癌性化学污染物氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC)[1]。酱油是发酵食品中EC的主要来源之一，阳性率和污染水平均位于前列，甚至高于酒精饮料，存在较高的食品安全风险[2,3]。

目前检测发酵食品中氨基甲酸乙酯常用的方法有高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)以及液相色谱-质谱联用法(LC-MS)等[4-6]。发酵食品的基质较饮料酒更为复杂，液相色谱法存在较强的杂质干扰，易出现假阳性；采用LC-MS法或GC-MS法时，因EC分子量小，碎片特征性不足，导致背景噪音大，方法特异性较差。

本文针对酱油类样品的特点，采用优化的QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe)[7]前处理方案，建立了四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱测定酱油中EC的方法。在测定中，考察了该检测方法应用于不同类型酱油产品中的基质效应，探讨了氨基甲酸乙酯的分子裂解规律，为研究降低酱油中氨基甲酸乙酯测定的基质效应提供了理论分析参考。

1 材料与方法

1.1 仪器及设备

UPLC-Q-Exactive超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪 美国Thermo Fisher公司；Multi Reax涡旋振荡器 德国Heidolph公司；Synergy超纯水系统 法国Millipore公司；MS 3 Digital涡旋混合器 德国IKA公司；2600TH超声波清洗器、0.22 μm水相滤膜 上海安谱仪器公司；AllegraX-30R高速离心机 美国Beckman Coulter公司；Poroshell 120 EC-C18色谱柱 美国Agilent公司。

1.2 试剂与样品

甲醇、乙腈：色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司；冰乙酸：分析纯，广州化学试剂厂；QuEChERS商用净化管：含N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基键合硅胶吸附剂(C18)、石墨化炭黑(GCB)、无水硫酸镁(MgSO4)：美国Agilent公司；氨基甲酸乙酯(EC，纯度99%)：美国Aladdin工业公司；氨基甲酸乙酯内标(EC-D5，纯度99.6%)：天津阿尔塔有限公司；实验室用水为超纯水；酱油样品：均购自广州市内超市。

1.3 实验方法

1.3.1 标准储备液的配制

准确称取EC和EC-D5标准品约10.0 mg，分别用乙腈溶解，然后转移至100 mL棕色容量瓶中定容，分别配制成100 mg/L的标准储备液，保存于4 ℃。根据试验情况，使用超纯水逐级稀释成适当浓度的工作液。

1.3.2 样品前处理

准确称取约5.00 g样品于50 mL聚丙烯离心管中，加入同位素内标EC-D5标准工作液，再加入10 mL乙腈，于涡旋振荡器上混匀提取10 min后，在6000 r/min的条件下冷冻离心3 min，待净化。

1.3.3 净化

取上层有机液5 mL，置于15 mL QuEChERS基质分散固相萃取净化管 (含400 mg PSA、400 mg C18、45 mg GCB以及1200 mg MgSO4)中，于涡旋振荡器上混匀，在6000 r/min的条件下离心3 min，取净化后的上清液1 mL，加水定容至5 mL，过0.22 μm水相滤膜，滤液待UPLC-MS进样分析。

1.4 仪器分析条件

1.4.1 色谱分析条件

色谱柱：Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)；流动相：A为0.1%乙酸水(V/V)，B为乙腈，等度洗脱(95%+5%，体积比)；进样量：5 μL；进样器温控：20 ℃；流速：0.25 mL/min；柱温：20 ℃。

1.4.2 质谱分析条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；离子源温度：350 ℃；接口温度：320 ℃；喷雾电压：3000 V(正离子模式)；一级质谱全扫描分辨率：70000；扫描范围：m/z 50～750； C-trap最大注入时间：50 ms；C-trap最大容量(AGC target)：1×106； PRM二级子离子全扫描分辨率：17500；二级C-trap最大容量：2×105；二级C-trap注入时间：100 ms；阶越式碰撞能(stepped NCE)：(25±15)%；定性离子对和定量离子对等质谱参数及保留时间见表1。

表1 EC和EC-D5的分子式及质谱参数Table 1 Molecular formulas and mass parameters of ethyl carbamate(EC)and EC-D5

2 结果与讨论

2.1 前处理方法优化

2.1.1 萃取溶剂选择

实验选用乙腈作为萃取试剂。EC水溶性好，乙腈对此类极性强的小分子化合物有较好的溶解性。此外，乙腈能对酱油基质有较好渗透，同时保证了提取较少亲脂性干扰物。酱油类样品含有大量的食盐，经盐析，乙腈层会与水相分层，该萃取过程有助于乙腈层保留较少的糖类与色素类杂质。

2.1.2 QuEChERS净化方法优化

目前QuEChERS净化方法使用的吸附剂主要是PSA、GCB、C18这3种物质，根据不同样品基质特点来单独或组合使用，以达到净化的目的。有研究人员利用Box-Behnken Design建模法[8]、Full Factorial Design全筛法等[9]实验优化吸附剂的组合，使净化效果最佳，并最终确立推广了一系列商业化的QuEChERS净化包，能针对各果蔬基质的主要干扰物进行相对应的净化。但酱油的成分相对于果蔬更为复杂，除含食盐外，还有多种氨基酸、糖类、有机酸、色素及香料等成分。老抽酱油还添加了焦糖，其样品颜色浓、粘稠度大，增加了样品净化难度。

因此，基于实验成本、效率考量，以老抽为样品基质，选择目前流通的各商业化QuEChERS净化方案(吸附剂净化方案A：填料含400 mg PSA、400 mg GCB、1200 mg MgSO4；方案B：含150 mg PSA、900 mg MgSO4；方案C：含400 mg PSA、400 mg C18、45 mg GCB、1200 mg MgSO4；方案D：含50 mg PSA、150 mg C18、900 mg MgSO4)开展实验。通过比较采用不同净化方法下EC加标的绝对回收率(加标浓度为5 μg/kg，外标法定量)、除色效果、净化液与空白处理液的EC-D5峰面积比值(因EC在样品中存在本底，故采用EC-D5)，综合得出酱油测定的最佳净化方法。

表2 不同净化方法下EC的加标回收率 与EC-D5峰面积比值Table 2 Spike recoveries of EC and peak area comparisons of EC-D5 by various purification methods

图1 不同净化方案的除色效果比较Fig.1 Comparison of color removal effect by various purification methods

由表2和图1可知，净化方案C除色效果最佳，且净化后的目标物峰响应有显著增强，同时也能满足EC的加标回收要求。因此，QuEChERS净化方案C可应用于酱油基质EC的测定。

2.2 基质效应评价

基质效应是指样品中除了目标分析物以外的其他成分对待测物浓度的影响，即基质对分析方法准确性的干扰[10]。高分辨质谱具有高分辨率和高灵敏性的特点，易受共流出物干扰及离子化效率的影响，在定量分析时需充分考虑样品基质效应。EC在酱油样品中存在本底值，因此使用EC的内标化合物EC-D5开展酱油基质效应评价实验。

以空白样品配制浓度为20 ng/mL的EC-D5标准溶液。取市售常见的酱油品种(烧烤汁、老抽、寿司酱油、生抽)，按照1.3.2和1.3.3方法提取净化，再用净化后的各样品处理液分别配制相同浓度的EC-D5基质标准溶液，每种酱油做6个基质平行。检测方法的基质效应(Matrix Effect)以基质标准溶液和溶剂标准溶液的EC-D5峰面积的比值来表示，即ME=(基质中分析物的峰面积÷纯溶剂分析物的峰面积-1)×100[11]。评价基质效应时，6个基质平行结果舍去最大值和最小值后，计算平均值。若ME>0，则表示该基质对EC存在基质增强效应，反之若ME<0，则表示该基质对EC存在基质抑制现象。不同酱油基质的基质效应见图2。

图2 酱油中EC测定的基质效应Fig.2 Matrix effect of EC detection in soy sauce

由图2可知，各酱油|ME|≤20%，其数值在误差区间浮动之内，实验方法对各酱油基质均无基质效应[12]。

2.3 色谱与质谱条件优化

氨基甲酸乙酯为一种有机碱，流动相呈酸性时，能提升离子化效率且使峰形对称，因此流动相水相选取了0.1%乙酸水；此外，EC极性较强，一般的反相柱难以保留，该方法采用全多孔硅胶核壳柱Poroshell 120 EC-C18，柱温设为20 ℃，流动相以柱子可耐受的较高比例水相：乙酸水-乙腈(95%+5%)等度洗脱[13]。EC和EC-D5色谱保留较好，峰形对称，见图3。

图3 EC和EC-D5平行反应监测(PRM)色谱图Fig.3 Parallel reaction monitoring (PRM) of EC and EC-D5

EC这类小分子化合物，结构相对简单，能形成较稳定的准分子离子峰[M+H]+(m/z 90.06496)。为在定量上能有较好的重现性，选择平行反应监测模式(PRM)进行测定：四级杆过滤后，阶跃式碰撞能(NCE)碎裂并叠加，高分辨的二级子离子完成专属定量。对于较明显的二级碎片离子进行分子拟合，同位素模拟，并筛选特征碎片，根据精确分子量的质量差推断出该小分子的裂解方式[14]，见图4和图5。

图4 测定的同位素分布(a)与EC的特征碎片 离子元素组成分析(b)Fig.4 Determination of isotope distribution (a) and element composition analysis of fragment ions of EC (b)

图5 EC的MS2裂解模式Fig.5 MS2 fragmentation pattern of EC

注：rHB表示电荷中心引发的重排(α，β)；rHC表示电荷中心引发的重排(γ)。

[CH4O2N]+(m/z 62.02378)作为特征离子，是EC化合物的定性和定量离子，在高分辨质谱中能找到该离子A1同位素峰，符合图5中MS2的裂解规律。

2.4 线性参数及检出限、定量限

取EC及EC-D5标准储备液加超纯水，配制成EC-D5的质量浓度均为20 μg/L，EC质量浓度分别为1，2，5，10，20 μg/L的标准工作液。按1.3和1.4所述方法条件进行测定，获得峰面积，采用最小二乘法进行回归分析，其中x为EC质量浓度与内标EC-D5质量浓度的比值，y为EC峰面积与内标EC-D5峰面积的比值，得到在1～20 μg/L范围内EC的线性回归方程y=-0.00573311+0.0425925x，相关系数(r2)为0.9997，线性关系良好。检出限(LOD，S/N=3)为0.5 μg/kg，定量限(LOQ，S/N=10)为1.5 μg/kg。

2.5 方法回收率及精密度

取不同基质类型的酱油样品，分别进行加标回收实验，EC加标水平分别为5，50 μg/kg，内标化合物EC-D5的加标水平为20 μg/kg，每个浓度做6次平行，内标法定量，方法回收率、相对标准偏差等结果见表3。

表3 不同基质类型的各酱油加标回收率 和相对标准偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of EC in different matrix types of soy sauce (n=6)

由表3可知，在不同加标水平下，各样品加标回收率在89.4%～108.3%之间，相对标准偏差(RSD)为0.7%～6.4%，可见该方法有着良好的精密度和准确度，符合实际检测分析要求。

2.6 实际样品的检测

采用本研究建立的检测方法对市场流通度较高的9种品牌酱油进行了测定，每个样品重复测定6次，结果见表4。

表4 市售酱油中EC的检测结果(n=6)Table 4 The determination results of EC in soy sauce (n=6)

由表4可知，酱油样品中EC的检出率较高，范围在11.98～41.70 μg/kg。

3 结论

本研究建立的四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测酱油类调味品中氨基甲酸乙酯的方法具有较好的检测灵敏度和准确度。Q-Exactive平行反应监测模式(PRM)可以筛取EC母离子和特征碎片的精确质量数，通过比对二级碎片的同位素分布初步推导出化合物的质谱裂解模式，PRM模式针对小分子能具有较高的定性、定量水平。将优化了净化方案的QuEChERS方法应用于酱油的前处理，使方法快速、高效、环境友好，且无基质效应，能满足于日常监督中的快速筛查和方法确证，为调味品的质量安全监管提供了检测方法保障。