迷迭香多酚提取工艺响应面优化及抑制李斯特菌活性研究

耿敬章

(陕西理工大学 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000)

迷迭香属于唇形科的芳香植物，具有丰富的使用价值[1,2]，在我国云南、贵州、广西、海南等地有种植。迷迭香是一种名贵的天然香料植物，在生长季节会散发一种清香气味[3,4]。迷迭香是西餐中经常使用的香料，经常使用在牛排、土豆等料理以及烤制品中。同时，迷迭香还被广泛用于医药、油炸食品、食品保鲜等[5,6]。研究表明，这些功能主要与迷迭香化学成分中的酚类和挥发油类有关[7]。迷迭香提取物中除了有熊果酸、α-蒎烯等物质外，还有鼠尾草酚、鼠尾草酸、迷迭香酸、迷迭香酚等二萜酚类物质。其中，二萜酚类物质具有明显的抗微生物活性，在抗菌、消炎方面发挥巨大作用[8]。李斯特菌存在于绝大多数食品中，肉类、蛋类、海产品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源[9-11]。因此，本文研究迷迭香多酚提取工艺及其抑制李斯特菌活性，以期对迷迭香多酚资源进行深层次挖掘和利用。

1 材料及方法

1.1 原料与试剂

迷迭香：购于当地中药材批发市场；乙醇、没食子酸、福林酚试剂、碳酸钠、石油醚等：中国医药(上海)化学试剂公司；胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)：上海缘肽生物技术有限公司；单增李斯特菌种：省农科院提供；其他试剂均为分析纯。

1.2 实验仪器与设备

电动搅拌机 江西安亭仪器设备厂；HZX-JA100电子天平 北京新阳仪器设备有限公司；DK-8D超级水浴锅 华立设备公司；721G型可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；循环真空泵 天津贝纳仪器设备有限公司；超声波发生仪 北京天辉化工设备有限公司；旋转蒸发仪、真空干燥箱 安徽高博科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 迷迭香多酚提取工艺流程

迷迭香干叶→筛选→鼓风干燥→粉碎→筛分→乙醇→超声波提取→滤渣再提取→合并滤液→萃取→浓缩→真空干燥→迷迭香多酚提取物[12]。

1.3.2 指标测定

总酚含量：Folin-Ciocalteu法测定总酚含量[13]。

提取率=(C×V/m)×100%。

式中：C为提取液总酚含量，mg/mL；V为体积，mL；m为原料质量，g[14]。

1.3.3 迷迭香多酚抑制李斯特菌活性实验

TSB培养基接种单增李斯特菌，37 ℃ 200 r/min摇床培养24 h，然后离心，添加生理盐水，获得200 CFU/mL菌悬液备用。用移液器吸取迷迭香多酚菌悬液到TSA培养基，然后涂布均匀，再加1%吐温80，稀释为200，100，50，25，12.5，6.25 mg/mL 6个梯度。以1%吐温80为空白对照实验，测抑菌圈直径，平行实验3次[15-17]。

2 结果与分析

2.1 液料比对提取迷迭香多酚的影响

设定提取迷迭香多酚其他各因素条件，选取6，10，14，18，22，26 6个水平的液料比提取迷迭香多酚，检测迷迭香多酚。有效成分提取的过程实质是一个传质过程，因此操作条件中的液料比对提取效果至关重要[18]。

图1 液料比对提取迷迭香多酚的影响Fig.1 Effect of liquid-material ratio on the extraction of rosemary polyphenols

由图1可知，液料比小于18时，提取率逐渐提高，这是因为迷迭香多酚不断从固体原料向液体溶剂传质，溶剂的渗透和有效成分的溶解进行较快。当液料比为18时，迷迭香多酚提取效果较好，提取率达到最大。当液料比大于18时，提取率反而降低，这可能是因为较高的液料比增加了传质推动力，使得提取效果下降。同时使用大量的溶剂会对实验后处理操作造成负担。因此，综合考虑，迷迭香多酚提取过程中，液料比为18较为适宜。

2.2 乙醇浓度对提取迷迭香多酚的影响

设定提取迷迭香多酚其他各因素条件，选取50%、55%、60%、65%、70%、75% 6个水平的乙醇浓度提取迷迭香多酚，检测迷迭香多酚。乙醇作为一种极性较强的溶剂，能提取出极性强或极性较弱的有效物质[19]。乙醇浓度的变化能影响提取物密度、黏度、介电常数等物理性质，进而影响提取率。

图2 乙醇浓度对提取迷迭香多酚的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction of rosemary polyphenols

由图2可知，迷迭香多酚的提取率随乙醇浓度的提高先增大后减小。当乙醇浓度分别为50%、55%时，迷迭香多酚提取率逐渐提高，当乙醇浓度提高到60%时，迷迭香多酚提取率达到最高，说明乙醇对提取多酚效果较好。当乙醇浓度大于60%时，迷迭香多酚提取率反而下降，这可能是由于其他一些弱极性成分溶出量增加，减缓了酚类物质向乙醇溶剂的扩散。因此，迷迭香多酚提取过程中，乙醇浓度为60%较为适宜。

2.3 超声波功率对提取迷迭香多酚的影响

设定提取迷迭香多酚其他各因素条件，选取200，250，300，350，400，450 W 6个水平的超声波功率提取迷迭香多酚，检测迷迭香多酚。超声波辅助提取是天然产物中有效成分提取的一个好方法，它操作简单，节省能耗，提取效果有保证[20]。

图3 超声波功率对提取迷迭香多酚的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction of rosemary polyphenols

由图3可知，随着超声波功率提高，迷迭香多酚提取率呈先上升后下降的趋势，当超声波功率为350 W时，迷迭香多酚提取率达到最高。这是由于随着超声功率提高，超声波引起的“空化效应”加强，迷迭香多酚渗透速率加快。但是，当超声波功率大于350 W时，高压环境致使迷迭香多酚的结构受损，且杂质溶出严重，导致迷迭香多酚提取率降低。因此，迷迭香多酚提取过程中，超声波功率为350 W较为适宜。

2.4 超声波时间对提取迷迭香多酚的影响

设定提取迷迭香多酚其他各因素条件，选取10，20，30，40，50，60 min 6个水平的超声波时间提取迷迭香多酚，检测迷迭香多酚。

图4 超声波时间对提取迷迭香多酚的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction of rosemary polyphenols

由图4可知，超声时间低于40 min时，迷迭香多酚提取率逐渐上升，当超声波时间为40 min时，提取率最大，之后逐渐下降。这可能是因为超声提取开始时，细胞破碎逐渐增加，因此迷迭香多酚含量不断提高。当超声40 min后，超声时间过长，迷迭香多酚已基本溶出且部分被损坏，所以提取率下降。因此，迷迭香多酚提取过程中，超声波时间为40 min较为适宜。

2.5 迷迭香多酚提取工艺条件优化实验

表1 响应面优化提取条件的因素和水平 Table 1 Factors and levels of optimizing the extraction conditions by response surface methodology

表2 迷迭香多酚提取条件实验结果Table 2 Experimental results of extraction conditions of rosemary polyphenols

续 表

由表1可知，迷迭香多酚提取条件中，液料比、乙醇浓度、超声波功率、超声波时间对结果影响显著。以下为提取率二次回归拟合方程：

提取率(%)=4.22—0.065A-0.10B+0.50C+0.080D-0.028AB-0.10AC-0.095AD-0.42BC+0.016BD+0.086CD-0.50A2-0.16B2-0.57C2-0.45D2。

式中：A是液料比，B是乙醇浓度，C是超声波功率，D是超声波时间。迷迭香多酚提取条件实验结果见表2，响应面实验结果分析见表3。

表3 响应面实验结果分析Table 3 Analysis of experimental results of response surface methodology

注：若“Prob>F”<0.05，表示因素为显著因素。

迷迭香多酚提取实验失拟项不显著，P值为0.8867，模型极显著，P值<0.0001，所以能对提取迷迭香多酚的条件进行预测。得到迷迭香多酚提取的最佳条件为液料比15，乙醇浓度56%，超声波功率376 W，超声波时间38 min。

图5 液料比和乙醇浓度的相互作用Fig.5 Interaction between liquid-material ratio and ethanol concentration

由图5可知，液料比与乙醇浓度的相互作用对提取迷迭香多酚的影响显著，随着液料比与乙醇浓度的增大，提取率先增后减，变化幅度不大。

图6 液料比和超声波功率的相互作用Fig.6 Interaction between liquid-material ratio and ultrasonic power

由图6可知，液料比与超声波功率的相互作用对提取迷迭香多酚的影响显著，随着液料比与超声波功率的提高，提取率先增后减，变化幅度较大。

图7 液料比和超声波时间的相互作用Fig.7 Interaction between liquid-material ratio and ultrasonic time

由图7可知，液料比与超声波时间相互作用对提取迷迭香多酚的影响显著，随着液料比与超声波时间的提高，提取率先增后减，变化幅度不大。

图8 乙醇浓度和超声波功率的相互作用Fig.8 Interaction between ethanol concentration and ultrasonic power

由图8可知，乙醇浓度与超声波功率的相互作用对提取迷迭香多酚的影响显著，随着乙醇浓度与超声波功率的提高，提取率先增后减，变化幅度较大。

图9 乙醇浓度和超声波时间的相互作用Fig.9 Interaction between ethanol concentration and ultrasonic time

由图9可知，乙醇浓度与超声波时间的相互作用对提取迷迭香多酚的影响显著，随着乙醇浓度与超声波时间的提高，提取率先增后减。

图10 超声波功率和超声波时间的相互作用Fig.10 Interaction between ultrasonic power and ultrasonic time

由图10可知，超声波功率与超声波时间的相互作用对提取迷迭香多酚的影响显著，随着超声波功率与超声波时间的提高，提取率先增后减。

2.6 验证

设计表4来验证响应面优化得到的提取迷迭香多酚的最佳条件的可靠性。

表4 结果验证Table 4 Verification of results

由表4可知，实验4的提取率最高，因此提取迷迭香多酚的最佳条件是液料比15，乙醇浓度56%，超声波功率376 W，超声波时间38 min。

2.7 迷迭香多酚抑制李斯特菌活性结果

图11 迷迭香多酚抑制李斯特菌活性结果Fig.11 Results of antibacterial activity of Listeria monocytogene by rosemary polyphenols

由图11可知，迷迭香多酚提取物是抑制李斯特菌的有效物质，且抑菌程度有所不同[21-23]。随着迷迭香多酚提取物浓度逐渐提高，抑菌圈直径逐渐增大，当浓度为200 mg/mL时，抑菌圈直径达到最大。这可能是因为迷迭香多酚损伤李斯特菌的细胞壁和细胞膜，又或者是影响了李斯特菌的呼吸能量代谢，甚至影响了李斯特菌的DNA，进而抑制了李斯特菌的活性[24，25]。

3 结论

响应面优化提取迷迭香多酚的实验模型和实际情况拟合度比较好，结果可用，迷迭香多酚提取的二次回归拟合方程如下：提取率(%)=4.22—0.065A-0.10B+0.50C+0.080D-0.028AB-0.10AC-0.095AD-0.42BC+0.016BD+0.086CD-0.50A2-0.16B2-0.57C2-0.45D2(式中：A是液料比，B是乙醇浓度，C是超声波功率，D是超声波时间)。迷迭香多酚提取的最佳条件是液料比15，乙醇浓度56%，超声波功率376 W，超声波时间38 min。

迷迭香多酚能在一定程度上抑制李斯特菌的活性，且随着迷迭香多酚的浓度提高，抑制程度增大。