天香丹对动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠IL-6、IL-10表达的影响

王思静， 张 华， 马学宽， 邢 科， 徐亦男， 安冬青,2

(1新疆医科大学中医学院； 2新疆名医名方特色方剂实验室， 乌鲁木齐 830011)

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是指以动脉内膜有脂质等血液成分的沉积、平滑肌细胞增生和胶原纤维增多,形成粥糜样含脂坏死病灶和血管壁硬化为主要表现的一种疾病，是心血管疾病的主要病理基础，由动脉粥样硬化导致的心血管疾病已经成为全球死亡的首要原因。国内外研究显示，我国的心血管病现患人数约3亿,其中2.7亿人患有高血压，冠心病人数约1 100万,心血管病死亡率居首位，高于肿瘤和其他疾病[1]。因此有效防治AS能够降低心血管疾病的发病率和死亡率。目前，对于AS的治疗主要以降脂、降血小板等方法，代表药物以他汀类为主。天香丹颗粒为新疆医科大学附属中医医院的院内制剂，前期研究表明，该药能有效缓解冠心病心绞痛发作,调节血脂水平，抗血栓形成，保护心肌细胞及血管内皮细胞,促进治疗性血管新生等[2-4]。天香丹颗粒由中药新塔花、丹参、红景天、降香配伍而成，新塔花具有抗炎镇痛、降压等功效[5-7]，丹参具有益气活血、抗氧化、保护心血管、改善心肌纤维功能[8-9]，红景天具有抗氧化、保护心血管、改善心肌缺血、增强免疫力等功效[10-11]，降香主要用于外伤出血、心血管病等[12]。本实验结合前期研究基础[13]，采用ApoE-/-小鼠建立AS动物模型，探究天香丹颗粒缓解AS病理变化过程，为天香丹有效治疗AS提供理论依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物30只健康雄性ApoE-/-小鼠，10只同品系C57小鼠，8周龄，体质量(19±1)g，购于北京维通利华公司，许可证号:SCXK(京)2016-0011。饲养于新疆医科大学第一附属医院医学动物实验中心，伦理审核编号:20171129-02。

1.2 仪器AB124型精密电子天平(上海海康电子仪器厂)，PM401型石蜡熔蜡箱(德国Leica公司)，5235型组织包埋机(日本SAKURA公司)，LKB-V型切片机(德国Leica公司);，5424R型低温高速离心机(德国Eppendrof公司)，DM2500型光学显微镜(德国Leica公司)，Type1500型多功能酶标仪(美国Thermo公司)。

1.3 试药天香丹颗粒(新疆医科大学附属中医医院院内制剂,新药制字：ZO400082)，阿托伐他汀(北京索莱宝科技有限公司，批号:20151223)，HE染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号:G1120)，胆固醇(北京索莱宝科技有限公司，批号:C8280)，丙硫氧基嘧啶(北京索莱宝科技有限公司，批号:YZ-100803)，小鼠IL-6 ELISA试剂盒(Thermo公司，批号:M0044C)，小鼠IL-10 ELISA试剂盒(美国Thermo公司，批号:R0016C)。

1.4 模型的建立将40只小鼠给予高脂饲料喂养，连续灌胃12 w，建立动脉粥样硬化动物模型，所有小鼠不限饮食饮水，活动自由。高脂饲料配方：基础饲料82.68%，猪油10.00%，猪胆盐0.20%，胆固醇2.00%，蔗糖5.00%，丙硫氧基嘧啶0.12%，由新疆医科大学动物中心提供。

1.5 动物分组及给药40只小鼠适应性饲养1周，将30只ApoE-/-小鼠随机分为模型组(0.4 mL/10 g,蒸馏水)、他汀组(3 mg·kg-1·d-1,阿托伐他汀)、天香丹组(2.7 g·kg-1·d-1,天香丹颗粒)，C57小鼠为空白组(0.4 mL/10 g,蒸馏水)，每组10只，每天灌胃1次，连续灌胃12周，每周记录小鼠体质量变化，并调整用药量。

1.6 标本采集各组小鼠灌胃第12周末，禁食不禁水12 h，麻醉后眼球取血，置于1.5 mL EP管中，7 500 r/min离心15 min，取血清置于-80℃冰箱保存备用；在无菌条件剖开小鼠胸腹腔，取主动脉根部至髂肾动脉分支处动脉组织，主动脉用10%甲醛固定，用于HE染色。

1.7 指标的检测

1.7.1 HE染色和斑块面积分析 将固定24 h以上的主动脉，依次经脱水、透明、浸蜡、包埋后，进行5 μm厚度切片，取5张效果较好的切片；HE染色后在光镜下观察主动脉形态学变化，计算主动脉斑块面积(PA)和管腔面积(LA)比值。

1.7.2 检测血清IL-6和IL-10表达水平 采用ELISA法检测，按照上海酶联生物ELISA试剂盒说明书严格操作，设置标曲。用酶标仪在450 nm波长处测定各孔吸光度值(OD值)，以浓度值为横坐标(X),各标准OD值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算出小鼠血清中IL-6和IL-10最终水平。

2 结果

2.1 小鼠主动脉病理形态学变化小鼠主动脉HE染色结果显示,空白组管壁几乎无脂质沉积，管腔无明显狭窄(图1A); 模型组内膜平滑肌细胞排序紊乱,出现大量脂质沉积和炎症细胞浸润，管腔狭窄，内壁破损，且有斑块形成(图1B); 他汀组斑块面积小于模型组，管腔狭窄不明显，未见斑块脱落与破裂(图1C); 天香丹组动脉粥样斑块面积小于模型组，大于空白组，有脂质浸润，管腔局部狭窄(图1D)。

A: 空白组

B:模型组

C:他汀组

D:天香丹组

图1 各组小鼠胸主动脉病理变化情况(HE ×200倍)

2.2 小鼠主动脉斑块面积/管腔面积比值(PA/LA)与空白对照组比较，模型组主动脉PA/LA比值增大，差异有统计学意义(P<0.01); 与模型组比较，天香丹组、他汀组主动脉PA/LA比值减小，差异有统计学意义(P<0.01); 与他汀组比较，天香丹组主动脉PA/LA比值增大，差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 各组小鼠主动脉斑块面积比较/%

注:与空白组比较,*P<0.01; 与模型组比较,#P<0.01; 与他汀组比较,△P>0.05。

2.3 小鼠血清IL-6和IL-10水平的比较与空白组比较，模型组小鼠血清中IL-6表达水平升高，IL-10表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.01); 与模型组比较，他汀组、天香丹组小鼠血清中IL-6表达水平降低，IL-10表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.01); 与他汀组比较，天香丹组小鼠血清中IL-6表达水平降低，IL-10表达水平升高，差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 小鼠血清IL-6和IL-10表达水平/(pg/mL)

注:与空白组比较,*P<0.01;与模型组比较,#P<0.01; 与他汀组比较,△P>0.05。

3 讨论

动脉粥样硬化作为心脑血管疾病主要病理基础，其发病机制复杂，研究证实，AS的发生发展均有炎症反应的参与。IL-6是AS形成的一个重要炎性反应因子，参与AS的形成和发展，由单核细胞、巨噬细胞产生的IL-10是一种重要的抑炎细胞因子，具有下调催化因子和炎性反应的作用，在限制血管壁炎性反应中具有积极作用，属于比较典型的抑炎因子。大量研究表明[14-16]，以冠心病为典型的心血管病患者机体内的促炎和抑炎因子平衡失调可能是AS发生发展的核心，因此如何进一步提升患者自身的抗炎能力很可能是治疗AS，防治心脑血管疾病新的靶向治疗点。本研究结果显示，天香丹颗粒能够有效缓解AS病理变化过程，减少AS斑块面积，下调炎症因子IL-6水平，上调抑炎因子IL-10的表达水平，抑制炎症反应，改善主动脉内皮功能，从而起到抗AS的作用。