长链非编码RNA ITGB1在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

赵 倩， 杨 亮， 朱丽萍

(新疆医科大学附属肿瘤医院乳腺外科一病区, 乌鲁木齐 830011)

乳腺癌的发病率不断增长，成为全球发病率最高的女性恶性肿瘤之一[1]，严重危及女性健康。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类转录本长度超过200 nt，不编码蛋白的RNA，这类RNA起初被认为是基因组转录的“噪音”[2]。随着2017年HOTAIR功能被发掘，lncRNA的功能渐渐明确。lncRNA常常与肿瘤的侵袭、转移和细胞生长有关，其表达量的异常及功能的变化能够明显影响多种恶性肿瘤的发生、发展等过程[3-4]。在癌症中，lncRNA可以作为癌基因和抑癌基因的转录调控分子，如过表达的lncRNA HOTAIR与乳腺癌[5]、结肠癌[6]和肝癌[7]有关，即lncRNA TARID可以预防癌症形成，通过甲基化抑癌基因的表达。Yan等[8]报道显示，lncRNA ITGB1在乳腺癌中发挥癌基因作用，促进乳腺癌细胞的迁移和扩增，但其在乳腺癌组织中的表达和临床意义，相关研究报道较少。本研究旨在探讨lncRNA ITGB1在乳腺癌及癌旁组织中的表达水平，以及与临床病理特征的相关性，为下一步寻找靶点基因提供一定的依据。

1 资料与方法

1.1 临床标本资料选择2017年1月-2018年12月新疆医科大学附属肿瘤医院乳腺外科一病区经病理确诊的90例乳腺癌患者。所有患者术前未接受放化疗、内分泌治疗及靶向治疗，术后病理确诊为乳腺癌，排除既往有恶性肿瘤病史、乳腺转移性癌。收集90例患者乳腺癌组织(病理类型为原发性浸润性癌)及配对癌旁组织(取自肿瘤组织>5 cm的乳腺正常组织)。标本迅速放入液氮中冷冻，并保存在-80℃冰箱中，用于RNA的提取。本研究经过医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂和实验仪器RNA提取试剂，TRIzolTMReagent(Ivitrogen，CA，美国)，DNA反转录试剂盒和PCR引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。荧光定量PCR仪：罗氏诊断产品(上海)有限公司，上海，型号：IQ5，电热恒温箱：汗诺仪器有限公司，上海，型号：DHP-42，立式压力蒸汽灭菌器：博迅实业有限公司医疗设备厂，上海，型号：YXQ-LS-3011，湿热灭菌器：SANYO公司，日本，型号：MLS-3750，琼脂糖凝胶电泳仪(北京六一生物科技有限公司，DYCP-31BN型)，nanodrop1000微量紫外可见分光光度计(Thermo)。

1.3 总RNA的提取对所有乳腺癌及癌旁组织标本切除后置于液氮中保存，各样本均取50～100 ng置于1.5 mL离心管中，加入1 mL TRIzol试剂，研磨5～10 min，使用TRIZD1试剂提取乳腺癌组织及癌旁组织样本中总RNA，分光光度计上检测各样本总RNA的浓度及纯度(A260/A280 nm)，选用GAPDH作为内参，内参目的基因GAPDH的设计和合成由宝生物有限公司合成。qRT-PCR引物序列如下，lncRNA ITGB1上游引物(F)：5′-CCTCTCAGCCTCCAGCGTTG-3′，下游引物(R)：5′-TGCTCTTGCTCACTCACACTCC-3′。GADPH：上游引物(F)：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物(R)：5′-GCAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′。

1.4 反转录得到cDNA按照反转录试剂盒的说明书对提取的总RNA进行逆转录得到cDNA，采用qRT-PCR的20 μL反应体系，反应条件如下：预变性95℃、30 s后，进行40个循环反应，95℃、5 s，60℃、34 s，运用溶解曲线检测扩增物纯度。

1.5 lncRNA ITGB1在乳腺癌的相对表达量，根据公式2-ΔΔCt计算lncRNA ITGB1在乳腺癌组织中的相对表达量，所有实验样本重复3次，取3次的ct值的平均值为最终值。△CT值=样本ct值-GAPDH ct值，将乳腺癌患者lncRNA ITGB1的表达水平的平均值作为cut-off值，分为高表达组和低表达组，进一步分析lncRNA ITGB1的表达水平与临床病理特征的相关性。

2 结果

2.1 lncRNA ITGB1在乳腺癌组织中的表达采用qRT-PCR法检测lncRNA ITGB1在乳腺癌组织和正常乳腺组织中的表达，如图1所示，乳腺癌组织中lncRNA ITGB1的表达水平(8.25±3.12)明显高于癌旁组织(1.31±0.25)，差异有统计学意义(t=18.551，P=0.000)。

图1 lincITGB1 在90对乳腺癌组织及癌旁组织中的表达量

2.2 乳腺癌患者组织中lncRNA ITGB1表达与临床病理特征的关系为分析lncRNA ITGB1的表达水平与乳腺癌患者临床病理特征的相关性，以乳腺癌患者lncRNA ITGB1的平均表达水平为cut-off值，高于其为高表达组，低于其为低表达组。lncRNA ITGB1的表达与TNM分期(P=0.000)和腋窝淋巴结转移(P=0.000)有关，但与年龄、肿瘤直径大小、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)以及分化程度无关(P>0.05)，见表1。

表1 lncRNA ITGB1与临床病理参数的关系/例

3 讨论

lncRNA本身不编码蛋白质，常以RNA的形式调控基因的表达，包括表观遗传学调控、转录调控和转录后调控等。近期相关研究结果显示，lncRNA是肿瘤诊断、预后及肿瘤风险预测的重要的分子标记物[9]。虽然在乳腺癌中已经有H19、UCA1、GAS5和HOTAIR等lncRNAs被发现，如研究发现HOTAIR通过在上皮间质转化(epithelial-to-mesencly transition，EMT)过程中调控Snail蛋白的表达，对肿瘤细胞增殖、凋亡作用显著。Cupta等[10]研究发现，HOIAIR在乳腺癌远处转移灶中表达明显升高，并认为HOATR是预测肿瘤转移和预后的重要指标，但是研究仍然有限。lncRNA ITGB1是一个新近研究发现的lncRNA，Wang等[11]首次发现其在膀胱癌中表达上调，并且研究证实ITGB1是由于其能调节EMT而促进膀胱癌的转移。Yan等[8]发现，lncRNA ITGB1可以促进乳腺癌细胞的扩增、迁移和侵袭作用。并且也发现其能够作为一个癌基因而影响EMT。

本研究从乳腺癌患者的临床特征出发，分析lncRNA ITGB1与乳腺癌临床病理特征的关系。本研究通过qRT-PCR方法检测了90例乳腺癌患者癌组织及正常癌旁组织中的表达，并分析该基因与相关临床病理特征的相关性。结果发现，lncRNA ITGB1在乳腺癌组织中高表达，明显高于癌旁正常乳腺组织。另外，本研究发现lncRNA ITGB1的表达水平与腋窝淋巴结转移和TNM分期有关，提示其与肿瘤的进展有关。另外，本研究存在一定的局限性，仅分析lncRNA ITGB1与临床病理特征的相关性，并没有分析lncRNA ITGB1在乳腺癌中的功能，后续实验可通过过表达ITGB1，分析其对乳腺癌细胞增殖和细胞周期的影响。

综上所述，lncRNA ITGB1在乳腺癌组织中的表达升高，提示高表达可以作为肿瘤生物标记物，为下一步寻找靶点基因提供了可靠依据。根据临床病理特点，乳腺癌分为Luminal A型、Luminal B型、HER-2过表达型和基地细胞型。乳腺癌的分子分型对其治疗方案的选择及临床预后的评估具有重要意义。吴艾冉等[12]分析lncRNA MIAT在乳腺癌不同分子亚型中的表达情况，发现其表达水平与乳腺癌分子分型等相关。本研究纳入90例乳腺癌患者，未对其分子分型进行进一步的分析，后继实验可进一步分析lncRNA ITGB1与乳腺癌分子分型之间的关系，以期为乳腺癌的个体化治疗及预后评估提供新的思路。另外，本研究选取的标本为2017年-2018年的乳腺癌患者组织,无法统计其预后情况，今后统计随访数据，进一步探讨lncRNA ITGB1与预后的关系。