高灵敏共振光散射技术测定药物及尿样中氨曲南

何树华, 曾庆瑞, 程乙真, 吴文婕, 江 虹

(长江师范学院化学化工学院，长江师范学院武陵山片区绿色发展协同创新中心，重庆 408100)

氨曲南(Aztreonam,ATN)是目前投入市场的第一个应用于临床的新型单环β-内酰胺类抗生素，该药对革兰阴性菌具有很强的抗菌活性，临床上主要用于治疗革兰阴性菌引起的各种感染，如由敏感菌所引起的呼吸系统感染、泌尿系统感染、生殖系统感染、皮肤感染及其它严重感染等。氨曲南的不良反应，如腹泻、恶心、呕吐、黄疸、药物性肝炎、紫癜、皮疹等均较少见，但用药过量或长期使用该药时，会对肝、肾功能及造血系统造成较严重的影响。因此，研究测定ATN含量的方法，对于保障用药安全具有重要意义。

目前，国内外对ATN含量的检测方法研究较少，已报道的主要是高效液相色谱法[1 - 6]，也偶有原子吸收法[7]、荧光法[8 - 9]、电化学法[10]及液-质联用法[11]等的报道。本工作以常见的碱性染料维多利亚蓝B(VIB)为探针，用高灵敏共振光散射(RLS)技术测定ATN的含量，尚未见文献报道。实验发现，在碱性条件下，ATN与VIB缔合物的RLS强度与ATN的浓度间有一定的线性关系。方法用于检测药物及人体尿液中ATN的含量，获得较好结果。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-2500型荧光分光光度计，日本日立公司；pHS-3C型酸度计，上海虹益仪器仪表有限公司。

氨曲南对照品(ATN)(96.9%，批号：130507-201303，中国食品药品检定研究院)溶液：准确称取适量的ATN对照品于小烧杯中，加少许甲醇使其溶解，再转入100 mL容量瓶中，用水定容，配成43.54 mg/L的贮备溶液，于冰箱4 ℃保存，临用时稀释成4.354 mg/L操作液。维多利亚蓝B(VIB)(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)溶液：1.0×10-4mol/L。Tris-HCl缓冲溶液：分别取0.10 mol/L HCl和0.20 mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液适量，混合后，用酸度计测定其pH值，配成pH=3.0～9.8的系列溶液。实验用水是二次蒸馏水。

1.2 实验方法

依序准确移取pH=9.34 Tris-HCl溶液3.00 mL，4.354 mg/L ATN标准溶液(或样液)适量，1.00×10-4mol/L VIB溶液3.00 mL于10 mL具塞比色管中，加水定容，5 min后，在荧光光度计上，于λex=λem=220 nm处(测定狭缝5.0 nm)，同步扫描体系的共振光散射(RLS)光谱，测定最大散射波长处，体系溶液及试剂空白溶液的RLS强度IRLS及I0，并计算ΔIRLS(ΔIRLS=IRLS-I0)。

2 结果与讨论

2.1 ATN-VIB的RLS光谱特征

图1 氨曲南与维多利亚蓝B的RLS光谱Fig.1 RLS spectra of aztreonam and victoria blue B1.0.435 mg/L ATN;2.3.00×10-5 mol/L VIB;3 - 9:0.0,0.0871,0.174,0.261,0.348,0.435,0.523 mg/L ATN-3.00×10-5 mol/L VIB, pH=9.34.

ATN与VIB反应体系的RLS光谱见图1。从图可知，ATN和VIB本身的RLS光谱均很微弱(曲线1和2)，当它们在pH=9.34的碱性条件下反应生成缔合物后，共振光散射强度明显增强，最大共振散射峰位于370 nm，在此波长下，共振光散射强度IRLS随着ATN浓度的增大而增强(曲线3～9)，并且ATN在一定浓度范围内与IRLS的增强强度呈线性关系，故该方法可用于ATN的定量分析。

反应机理：VIB在溶液中以阳离子形式存在，而ATN分子结构中有一个磺酸根离子和一个羧酸根离子，在溶液中VIB与ATN可以静电引力结合生成二元离子缔合物，使体系摩尔质量增大(由原来ATN的摩尔质量增大到ATN与VIB结合生成的缔合物的摩尔质量)，故体系的RLS明显增强。

2.2 反应条件

2.2.1 溶液pH的影响室温下，试验了甲基紫-ATN、碱性品红-ATN及VIB-ATN体系在同一酸性或同一碱性条件下对RLS的影响。结果表明，在碱性Tris-HCl介质中，VIB-ATN体系有较强的RLS信号，故选用VIB作探针测定ATN。继而改变反应体系中Tris-HCl溶液的pH值，考察其对ΔIRLS的影响，结果见图2。反应在pH=8.5～9.8范围内，体系有较大且较稳定的ΔIRLS，即有较高的灵敏度。实验选用pH=9.34，当缓冲溶液用量为3.00 mL时，体系ΔIRLS相对最大且稳定。故实验用pH=9.34的Tris-HCl溶液3.00 mL来控制反应的酸度。

2.2.2 VIB溶液浓度的影响室温下，改变反应体系中VIB溶液的浓度，考察其对ΔIRLS的影响，结果见图3。VIB溶液浓度在2.70×10-5～3.30×10-5mol/L范围内，体系有较大且稳定的ΔIRLS，浓度为3.00×10-5mol/L时ΔIRLS达最大，灵敏度最高。VIB溶液的浓度大于或小于3.00×10-5mol/L，反应体系的ΔIRLS均有不同程度的降低。降低原因是：要么反应不完全，要么VIB过量使自身聚集作用增大，从而导致体系ΔIRLS有所降低。故实验用1.00×10-4mol/L VIB溶液3.00 mL来保障方法有高的灵敏度。

图2 pH值对ΔIRLS的影响Fig.2 Effect of buffer pH on ΔIRLS

图3 维多利亚蓝B溶液浓度对ΔIRLS的影响Fig.3 Effect of victoria blue B concentration on ΔIRLS

2.2.3 试剂加入顺序的影响室温下，改变反应体系中试剂的加入顺序，考察其对ΔIRLS的影响。实验表明，灵敏度相对较高时，试剂加入顺序为：Tris-HCl溶液、ATN溶液、VIB溶液，反应体系的ΔIRLS相对最大。

2.2.4 反应速度及RLS强度的稳定性室温下，改变反应体系中ATN和VIB溶液的反应时间，考察其对ΔIRLS的影响。实验表明，ATN和VIB的反应5 min即可完成，稳定时间至少1 h。实验选在5 min后测定。

2.3 共存物质的影响

图4 标准曲线Fig.4 Calibration curve

2.4 ATN浓度与ΔIRLS的关系

在选定的最佳实验条件下，按实验方法配制ATN标准系列溶液，扫描RLS光谱。作ATN的工作曲线(ΔIRLS-c曲线)，如图4所示。反应体系的ΔIRLS与ATN的质量浓度在0.003～0.52 mg/L范围内呈良好的线性关系，线性回归方程为:ΔIRLS=-7.236+625.6c(mg/L)，相关系数r=0.9988，检出限(3Sb/S)为0.0023 mg/L，可见方法有较宽的线性范围及很高的灵敏度。

2.5 样品分析

2.5.1 样液的制备取重庆某药业股份有限公司和山西某药业有限公司生产的注射用ATN各1支(分别编为1#和2#)，将全部内容物分别置于小烧杯中，加少许甲醇搅拌，待ATN溶解后，转入1 000 mL容量瓶中，加水定容。取1#和2#定容液各5.00 mL，分别用水稀至1 000 mL，即为1#和2#待测液。取健康人体新鲜尿液(编为3#)适量，过滤后稀释10倍，即得待测液。

2.5.2 样液的测定及回收试验取1#待测液0.50 mL，2#待测液0.20 mL，3#待测液2.00 mL，分别按实验方法测定各样品中ATN的含量(各平行测定5份)。再做3种不同加标梯度的回收试验(各梯度平行测定5份)，结果见表1。

表1 样品分析结果及回收试验(n=5)

ND：notdetected.

3 结论

用共振光散射技术测定ATN的含量具有高灵敏度和高选择性，较宽线性范围，较高准确度和精密度；所用仪器只需一般的荧光分光光度计，易于普及，所需药品为一般常用试剂，分析成本低。该方法适于药物及人体尿液中ATN含量的定量分析。