核壳式Ag@MIPs的制备及对氨苄西林的表面增强拉曼光谱检测

李 轩, 李利军*, 程 昊, 冯 军, 徐娅娟, 李笑轩

(1.广西科技大学生物与化学工程学院,广西柳州 545006；2.广西糖资源绿色加工重点实验室，广西柳州 545006；3.广西高校糖源加工重点实验室，广西柳州 545006)

氨苄西林(Ampicillin,AMP)，又称氨苄青霉素，它是一种β-内酰胺类抗生素，可治疗多种细菌感染。在饲养动物过程中，过量使用AMP将会造成其在蛋类、肉类等动物源性食品中残留[1 - 2]，而长期食用这类食品会造成人体产生耐药菌株，进而影响一些疾病的治疗[3 - 4]。因此，发展快速、准确、灵敏的AMP检测方法具有重要意义。目前，AMP的检测方法主要有高效液相色谱法[5]、液-质联用法[6]等，但这些方法或操作繁琐耗时，或难以检测复杂样品。韩斯琴高娃等[7]以Al2O3陶瓷作衬底，利用Ag溶胶对AMP林拉曼光谱的增强效应，建立了AMP的表面增强拉曼光谱(SERS)定性检测方法，但灵敏度较低，且未能选择性检测。拉曼光谱可实现对物质的无损、快速检测[8]，而SERS可以克服常规拉曼光谱灵敏度较低的缺陷，极大增强被测物质的拉曼信号。目前，以贵重金属纳米粒子作为基底在SERS中应用较多，但稳定性较差且不具备特异识别功能[9]。分子印迹技术不仅可改善纳米Ag基底的化学稳定性，并且具备特异识别性[10 - 13]。

表面粗糙程度较大的Ag基底具有较强的拉曼增强响应，并且拉曼增强效果集中在凸起和棱角部位[14 - 15]。本文通过抗坏血酸还原法合成表面类似毛线团的Ag微球，并以AMP为模板分子，丙基三甲氧基硅烷(MPS)为硅烷化试剂，丙烯酸(MAA)为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)为交联剂，2,2-偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，在Ag微球表面制备AMP分子印迹聚合物(Ag@MIPs)，采用激光共聚焦拉曼光谱仪(激发波长为638 nm)，以Ag@MIPs为基底对AMP进行检测。结果表明，所制备的Ag@MIPs 具有较强的SERS效果，增强因子达3.79×105，对AMP的检测限可达到1.0×10-8mol/L。同时，以Ag@MIPs为基底，对相同浓度的氨苄西林、阿莫西林和苯唑西林混合溶液进行特异性吸附试验，结果表明Ag@MIPs对AMP具有较高的选择性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Hitachi S-4800冷场发射扫描电子显微镜(日本，日立公司)；JEM 2100透射电子显微镜(日本，JEOL公司)；BrukerD8A A25 X射线衍射仪(德国，布鲁克公司)；Frontier傅里叶红外光谱仪(美国，Perkin Elmer公司)；XploRAPLUS激光共聚焦拉曼光谱仪(日本，Horiba公司)。

氨苄西林(AMP)、3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS，使用前经活性炭吸附处理以除去阻聚剂)购于上海麦克林生化科技有限公司；甲基丙烯酸(MAA)购于成都科隆化工试剂厂；2,2-偶氮二异丁腈(AIBN)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)购于美国阿拉丁工业公司；AgNO3、聚乙烯吡咯烷酮K-30(PVP)购于国药集团化学试剂有限公司；抗坏血酸购于广东光华科技股份有限公司；无水乙醇购于西陇科学股份有限公司；乙腈购于天津市科密欧化学试剂有限公司。所用试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.2 材料的制备

Ag微球的制备参考文献方法[16]，并在其基础上进行改进：取0.2 mL AgNO3溶液(1 mol/L)分散于10 mL PVP溶液(质量分数0.1%)中，磁力搅拌5 min。向上述溶液中迅速滴加2 mL 0.1 mol/L抗坏血酸溶液，反应10 min。产物用超纯水与无水乙醇各洗涤3次后，置于真空烘箱中40 ℃干燥24 h，待用。

Ag@MPS的制备：取上述所得粒子400 mg分散于50 mL乙醇-水溶液(4∶1)中，超声10 min，加入4 mL MPS，磁力搅拌5 min，充入N2后置于油浴中40 ℃反应24 h。离心分离得产物，分别用超纯水与无水乙醇各洗涤3次，置于真空烘箱中40 ℃干燥24 h，备用。

Ag@MIPs的制备：称取100 mg AMP，超声分散于50 mL乙醇-乙腈(1∶1)中，加入100 μL MAA，磁力搅拌5 min。向上述溶液中加入150 mg Ag@MPS，超声10 min，加入4 mL EGDMA，磁力搅拌10 min，然后加入1 mg AIBN，在N2保护下，60 ℃油浴反应24 h。将离心所得产物用乙酸-水溶液(4∶1)洗脱直至无AMP检出。最后，分别用超纯水与无水乙醇各洗涤3次，置于真空烘箱中40 ℃干燥24 h。

1.3 样品的制备与拉曼光谱采集

分别取10 mg Ag微球和核壳式Ag@MIPs微球，加入1 mL不同浓度的AMP溶液或氨苄西林、阿莫西林和苯唑西林混合溶液，超声10 min，滴到石英玻璃片上晾干，采集拉曼光谱。分别称取不同剂型的AMP 4 mg，用10 mL超纯水配制成溶液，然后分别取10 mg Ag@MIPs微球，加入1 mL不同剂型的AMP溶液，超声10 min，滴到石英玻璃片上晾干，采集拉曼光谱。光谱参数为：波长为638 nm，积分时间为10 s，平均次数为1次。

2 结果与讨论

2.1 Ag、Ag@MIPs的扫描电镜和透射电镜表征

图1是Ag微球、Ag@MIPs的扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)图。从图1a可以看出，该方法制备的Ag微球表面类似毛线团。对比图1b和1c不难看出Ag微球表面包裹了一层透光度较高的薄膜，可初步确定在Ag微球的表面包覆有AMP分子印迹聚合物。

图1 扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)图Fig.1 SEM and TEM images(a)SEM images of Ag;(b)TEM images of Ag;(c)TEM images of Ag@MIPs.

2.2 Ag@MPS和Ag@MIPs的能谱表征

图2为Ag@MPS、Ag@MIPs的能谱(EDS)图。图2a中Ag元素的谱峰来自Ag微粒，Si元素来自于MPS，C元素可能来自于MPS或PVP。图2b中，Ag元素谱峰来自于Ag微粒，Si元素来自于MPS，N、S元素来自于模板分子AMP。可以进一步证明，Ag微球表面包覆AMP分子印迹聚合物。

图2 Ag@MPS(a)和Ag@MIPs(b)的能谱(EDS)图Fig.2 EDS of Ag@MPS(a) and Ag@MIPs(b)

2.3 Ag、Ag@MPS和Ag@MIPs的红外光谱表征

图3是Ag、Ag@MPS和Ag@MIPs的红外(IR)光谱图。可以看出，制备的Ag微球表面并无其它杂质；Ag@MPS在870 cm-1、1 088 cm-1处出现较为明显的吸收峰，它们是Si-O键伸缩振动引起；Ag@MIPs在2 990 cm-1处有较为明显吸收峰，这是AMP中的-CH3伸缩振动引起；1 738 cm-1处的吸收峰，来自AMP中四元环羰基；1 732 cm-1处的吸收峰来自交联剂酯羰基；1 716 cm-1处的吸收峰可能来自单体或氨苄西林中的羧酸羰基；1 635 cm-1、1 580 cm-1、1 450 cm-1处的吸收峰是由AMP中的苯环骨架振动引起的，1 385 cm-1、1 264 cm-1、1 164 cm-1处的吸收峰由AMP中的C-N的伸缩振动引起。这些特征峰的出现，进一步证明了Ag@MPS 和Ag@MIPs成功制备。

2.4 Ag、Ag@MPS和Ag@MIPs的X射线衍射表征

图4为Ag微球、Ag@MPS和Ag@MIPs的X射线衍射(XRD)谱图，其扫描步长为30°～80°。从图中可知，在2θ=38.175°、44.13°、64.630°、77.606°处出现了明显的衍射峰，通过对比标准PDF卡片(87-0720)，这些衍射峰分别对应Ag的(111)、(200)、(220)和(311)晶面。对比Ag微球的XRD谱图可以发现，Ag@MPS 和Ag@MIPs的衍射峰位置并未发生偏移，表明Ag微球表面包覆聚合物后，Ag微球晶型并未发生改变，只是衍射峰强度变弱，其中(111)对应晶面峰的强度降低最大。

图3 Ag、Ag@MPS和Ag@MIPs的傅立叶红外(FT-IR)光谱图Fig.3 FT-IR spectra of Ag，Ag@MPS and Ag@MIPs

图4 Ag、Ag@MPS、Ag@MIPs的X射线衍射(XRD)谱图Fig.4 XRD of Ag,Ag@MPS and Ag@MIPs

图5 Ag@MIPs基底洗脱不同时间的拉曼谱图Fig.5 Raman spectra of Ag@MIPs substrate eluted at different times(a) 0 h;(b) 2 h;(c) 12 h;(d) 24 h.

2.5 Ag@MIPs中氨苄西林残留的考察

图5中曲线a、b、c、d分别为Ag@MIPs基底洗脱0、2、12、24 h的拉曼光谱图。可以发现，随着洗脱时间的推移，Ag@MIPs基底的拉曼峰强度逐渐在降低，洗脱24 h后，几乎看不到基底的拉曼峰。因此可以断定，Ag@MIPs基底上的模板分子已经完全洗脱。

2.6 AMP在Ag微球与Ag@MIPs基底上的SERS

图6中曲线a是AMP标准品的拉曼光谱图,曲线b、c分别是AMP溶液(1.0×10-3mol/L)在Ag@MIPs和Ag微球基底上的SERS谱图。对照标准品的拉曼谱图可以发现Ag微球与Ag@MIPs对AMP的1 040 cm-1(β-内酰胺环振动引起)、1 065 cm-1(苯环C-H键弯曲振动引起)、1 151 cm-1(羧基C-O键振动引起)等峰位置有明显增强[17 - 18]。通过对比Ag微球和Ag@MIPs 的SERS的特征峰可以发现，在相同浓度的AMP溶液中，Ag@MIPs的特征峰强度明显高于Ag微球，这是由于Ag@MIPs对AMP的富集作用使其SERS信号增强。

2.7 Ag@MIPs的SERS检测限

图7分别是1.0×10-3～1.0×10-8mol/L的AMP溶液在Ag@MIPs基底上的拉曼谱图。可以看出，随着AMP浓度的降低，对应的峰强度逐渐减弱。当AMP溶液的浓度为1.0×10-8mol/L时，吸收峰强度极弱。这是由于随着AMP溶液浓度的降低，Ag@MIPs吸附的AMP分子减少，激光照到单位面积的AMP分子也随之逐渐减少，导致拉曼光谱的信号逐渐减弱。当AMP溶液的浓度为1.0×10-8mol/L时，吸收峰强度极弱，由此可以断定1.0×10-8mol/L为Ag@MIPs基底上拉曼检测限。

图6 氨苄西林标准拉曼谱图(a),氨苄西林(1.0×10-3 mol/L)在Ag@MIPs基底(b)和Ag微球基底(c)的SERSFig.6 Raman spectra of AMP standard (a),SERS of AMP(1.0×10-3 mol/L) on Ag@MIPs substrate(b) and Ag substrate(c)

图7 不同浓度氨苄西林溶液在Ag@MIPs基底上的SERSFig.7 SERS spectra of different concentration of AMP solution on Ag@MIPs substrate

根据拉曼增强因子(EF)的公式[19]，计算Ag@MIPs基底的EF：本文以1.0×10-3mol/L AMP1 040 cm-1处特征峰强度作为I值，结果为3.79×105。为考察不同浓度AMP与其SERS峰强度的线性相关性，以AMP浓度的对数为横坐标，不同浓度(1.0×10-3～1.0×10-8mol/L)的AMP在1 040 cm-1处的特征峰强度为纵坐标进行线性拟合，线性回归方程为：y=850.4x+6 670，相关系数R2=0.959。因此，可以通过检测AMP的特征峰强度实现其定量检测。

为了进一步验证AMP在Ag@MIPs基底上的拉曼光谱重现性，采集浓度为1.0×10-5mol/L的6个样品的SERS信号。所得结果(图略)可以看出6个样品在1 040 cm-1处的拉曼峰强度变化不大，说明AMP在Ag@MIPs基底上的光谱重现性较好。

2.8 Ag@MIPs的竞争吸附研究

图8中曲线a是AMP标准品的SERS谱图，曲线b、c是氨苄西林西(1.0×10-3mol/L)、阿莫西林(1.0×10-3mol/L)和苯唑西林(1.0×10-3mol/L)混合溶液分别在Ag@MIPs和Ag微球基底上的SERS谱图。对比AMP标准品可以看出，在500～2 000 cm-1范围内，以Ag微球作基底时除了有AMP在1 040、1 065、1 151 cm-1特征峰外，还在1 272、1 418、1 594、1 628 cm-1出现了属于阿莫西林和苯唑西林的吸收峰；而以Ag@MIPs作基底时AMP的吸收峰较为明显，阿莫西林和苯唑西林的特征峰很低，几乎被AMP的特征峰覆盖。这是因为Ag@MIPs中具有和AMP分子空间结构相匹配的结合位点，可以特异性识别并吸附AMP分子。综上，Ag@MIPs基底对AMP具有特异吸附性，可在实际样品的检测中排除其他杂质分子的干扰。

2.9 不同剂型AMP的SERS检测

图9为三种不同剂型的AMP溶液在Ag@MIPs基底上的SERS谱图。从图中可以看出，不同剂型的AMP溶液在1 040 cm-1处都有较强的拉曼吸收峰，说明该基底在检测实际AMP药品时，可以较好排除其它辅料成分的影响。

图8 氨苄西林标准品(a)、氨苄西林、阿莫西林和苯唑西林混合溶液在Ag@MIPs基底(b)和在Ag基底上(c)的SERS谱图Fig.8 SERS spectra of AMP standard(a),AMP and AMX with OXA mixtures on Ag@MIPs(b) and on Ag substrate

图9 不同剂型的氨苄西林溶液的SERS谱图Fig.9 SERS spectra of AMP solution with different dosage forms

3 结论

通过分子印迹技术成功制备出核壳型Ag@MIPs，以核壳式Ag@MIPs为基底，将其运用到AMP的SERS检测。实验结果表明，该方法制备的核壳式Ag@MIPs具有粒径均一、分散性好、模板分子易洗脱等特点；利用该基底对AMP检测有快速、灵敏、光谱重现性好、选择性强等优点，可用于实际样品中的AMP的SERS检测。