高效液相色谱-串联质谱法同时测定沙棘中的11种黄酮类物质

蔡 爽， 阮成江， 杜 维， 丁 健， 韩 平， 王海明

(生物技术与资源利用教育部重点实验室，大连民族大学资源植物研究所，辽宁大连 116600)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)为胡颓子科(Elaeagnaceae)沙棘属落叶灌木或小乔木，主要分布于欧亚大陆的温带地区，是一种珍贵的药食同源植物[1]。沙棘果实和叶片富含维生素、氨基酸、微量元素、萜类和黄酮类化合物等生物活性物质，其中沙棘黄酮具有降低胆固醉、改善心肌供血状态、净化血液、抗氧化、抗衰老，以及抗肿瘤和诱导肿瘤细胞凋亡等生理功效及显著的药理功能[2 - 3]。

黄酮类化合物种类多，且大多与不同糖结合形成苷，较难测定，而建立合理的测定方法是黄酮类化合物分析的难题[4]。目前常用的黄酮类物质测定方法有分光光度法、高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)。分光光度法用于测定黄酮总含量，易受杂质干扰致定量准确性差、重现性低[5]；高效液相色谱法分离度要求高且只能对少数几种黄酮进行定量[6]。HPLC-MS/MS法具有检测器选择性强、灵敏度高、抗干扰强等优势[7 - 9]，能快速、准确的定量，利于从植物的提取物中发现微量目标成分[10]；作为一种软电离的电喷雾离子源，能产生分子和离子碎片来解析化合物结构，现已在鉴定天然产物结构研究中被广泛应用[11 - 12]。采用HPLC-MS/MS法已分别从沙棘叶和果实中检测出的黄酮类物质主要有：山奈酚、槲皮素、芦丁、异鼠李素和柚皮素[13 - 17]，但未见应用HPLC-MS/MS同时检测沙棘种子和叶片中黄酮类化合物及其含量的报道。本研究以14份沙棘样品(11份种子：新俄、浑金、芬兰、TF-23、2013-10、34、HS-22、06卷叶、大长果42、向阳Ⅰ和TF2-13；3份叶片：5、7、8)为材料，探索了乙醇提取沙棘种子和叶片中的黄酮类成分的样品处理方法，建立了HPLC-MS/MS法同时分离检测沙棘种子和叶片中异鼠李素、槲皮素、山奈酚、表没食子儿茶素、芦丁、没食子儿茶素没食子酸酯、柚皮素、表儿茶素没食子酸酯、木犀草素、柚皮苷和表儿茶素11种黄酮类物质的方法。本方法简便快速、准确可靠，可作为一种高通量的快速测定沙棘种子和叶片中黄酮类化合物的方法，对沙棘种质资源的选择和开发利用具有重要意义。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

API3200三重四极杆质谱仪(美国，AB公司)；DGU-20A液相色谱系统(日本，岛津公司)；SB52000超声波清洗机(宁波新艺超声波设备有限公司)。

黄酮类化合物：异鼠李素、槲皮素、山奈酚、表没食子儿茶素、芦丁、没食子儿茶素没食子酸酯、柚皮素和表儿茶素没食子酸酯标准品购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均在99.99%以上；木犀草素、柚皮苷和表儿茶素标准品购自上海安普实验科技股份有限公司，纯度均在99.99%以上；无水乙醇为分析纯(科密欧)；甲酸和甲醇为色谱纯(Honeywell)。

2017年8月，在黑龙江省农业科学院浆果研究所沙棘种质资源圃内，分别采收11份沙棘种子样品及3份沙棘叶片样品。取样后经液氮冷冻，于-80 ℃保存。

1.2 标准品溶液配制

精确称取各标准品5 mg，溶于5 mL甲醇，配制成1 mg/mL的单标储备液；分别取50 μL各单标储备液于新棕色瓶中，加甲醇稀释到5 mL，浓度为10 μg/mL；各取50 μL 10 μg/mL的溶液，加甲醇稀释到5 mL，浓度为0.1 μg/mL，用于优化质谱条件。单标储备液逐级稀释成6个浓度梯度(10、20、50、100、500、1 000 ng/mL)，配制成混合标准溶液，用于标准曲线测定。

1.3 供试品溶液配制

准确称取1～2 g经液氮研磨后的样品粉末，溶于10 mL 75%的乙醇，超声提取1 h后，离心(4 ℃、4 500 r/min、20 min)，重复提取2次，合并上清液。上清液用20 mL石油醚反复萃取除去色素。取0.5 mL萃取溶液，加甲醇定容到5 mL。取1 mL稀释后的溶液，经0.22 μm微孔有机滤膜过滤，待测。

1.4 实验条件

1.4.1 色谱条件色谱柱：岛津C18色谱柱(50×2.1 mm，1.9 μm)；流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为甲醇；70%B等度洗脱程序，流速为0.2 mL/min；采集时间为10 min；柱温为30 ℃；进样量为2 μL。

1.4.2 质谱条件电喷雾离子源，负离子模式(ESI-)；干燥气(N2)温度为550 ℃；气帘气压力为30 psi；离子化电压为-4 500 V；扫描方式为多反应监测(MRM)模式。

2 结果与讨论

2.1 分析方法选择

分别采用75%、50%和30%乙醇提取沙棘种子和叶片中的黄酮类化合物，再经聚酰胺柱净化，以芦丁标准品为对照，采用分光光度法测定总黄酮含量，所得结果相差在4.5倍以上。这主要由于分光光度法的前处理过程过长，结果不稳定，很难精确测定总黄酮含量。本研究建立的方法为：样品用75%乙醇水解后，经超声提取，再用HPLC-MS/MS法测定，能同时快速准确的定量多种黄酮类物质。

2.2 色谱条件优化

采用柱长为150 mm的色谱柱，进行梯度洗脱，但仅能测出部分样品中的部分黄酮成分。为有效进行黄酮成分分离，本方法采用柱长为50 mm的色谱柱，各黄酮组分得到了较好分离。流动相对色谱分离效果和被测物的检测灵敏度存在影响。本研究分别对比了三种流动相体系：0.1%甲酸溶液-甲醇、0.1%甲酸溶液-乙醇和0.1%甲酸溶液-水。结果表明，0.1%甲酸溶液-甲醇作为流动相时色谱峰分离度较好，峰形对称，基线平稳，保留时间适中，同时被检物检出限低，最低(柚皮苷)能达到0.1 μg/L。因此，本方法采用0.1%甲酸溶液-甲醇作为流动相，等度洗脱，在此条件下监测得到的11种黄酮的MRM色谱图质量好，清晰度高，如图1所示。

2.3 质谱条件优化

电喷雾的“离子雾化”只产生高丰度的准分子离子峰，既可测定不稳定的极性化合物，又可直接分析混合物；同时，多电荷离子的形成也可分析大分子量化合物。为获得二次碎裂产生的子离子，需分别对母离子进行碰撞诱导解离。定性离子对需选择离子丰度高、基线噪声低的两对离子，其中前者可作定量离子对；在此基础上，逐个优化对灵敏度影响较大的碰撞能量及源内碎裂电压，使选定的子离子组成的特征离子的丰度和比例达到最佳[4]。质谱分析参数的最终优化结果见表1。

表1 沙棘11种黄酮类化合物的保留时间及质谱分析参数

(续表1)

No.NameRetention time(min)Parent ion(m/z)Daughter ion(m/z)Collision energy(eV)Declusteringpotential(V)9Luteolin1.36284.7133.0∗135.8-46.4-65.010Naringin0.77579.5150.9∗116.0-52.0-80.011L-Epicatechin0.71289.1245.0∗123.9-20.0-58.0

*Quantitative ions.

2.4 线性范围、检出限和定量限

将质量浓度为10、20、50、100、500、1 000 ng/mL的11种混合对照品溶液分别在最优条件下测定，得出11种物质浓度与峰面积的关系，每个校准曲线相关系数r均大于0.99，呈高度线性相关。以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)分别确定分析方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)。相关参数见表2。

2.5 精密度和基质效应考察

最佳实验条件下，对日内精密度和日间精密度进行考察，每个浓度水平连续测定6次。结果表明，11种黄酮类化合物的日内精密度和日间精密度分别在5.3%和8.0%以下，回收率>90.9%(表2)，满足定量分析要求。液-质联用中基质效应体现在被测物的离子化程度会受到样品中杂质的影响，使结果升高或降低，如杂质在某种程度上会抑制ESI离子源中被测物的电离[16]。基质效应强弱的评价标准是将被测物标准品加入到不含被测物成分的样本中测定，与预期结果相比，观察测定数据变化[17 - 18]。本研究采用处理后加标法考察基质效应，异鼠李素、芦丁和表儿茶素没食子酸酯的加标回收率范围在90.9%～100.2%，接近100%，说明基质对这3种黄酮成分的抑制效应很弱。表儿茶素和槲皮素的加标回收率分别为90.9%和91.85%，表明这2种黄酮组分受基质抑制作用相对较强。其他7种黄酮组分的加标回收率范围在94.25%～97.6%之间，抑制作用较弱。结果表明，基质对大部分黄酮成分有较低抑制效应，且效应不明显。这可能由于各物质已充分分离或样品稀释倍数较大，所以目标物质的定量不受基质影响。

表2 11种黄酮类化合物的线性方程、线性范围、相关系数、检出限(LODs)、定量限(LOQs)和精密度

Note：1:isorhamnetin;2:quercetin;3:kaempferol;4:(-)-epigallocatechin;5:rutin;6:(-)-gallocatechingallate;7:naringenin;8:(-)-epicatechingallate;9:luteolin;10:naringin;11:L-epicatechin.

2.6 方法的实际应用

采用本研究建立的高效液相色谱-串联质谱法同时检测沙棘种子和叶片中11种黄酮类化合物，检测结果表明，不同种质种子和种质叶片中的不同黄酮类化合物间存在明显差异。沙棘叶片中检测出了除柚皮素外的10种黄酮类化合物，种子中检测出了除山奈酚外的10种黄酮类化合物，结果见表3。

表3 11份沙棘种子中的10种黄酮类成分含量(μg/g)

Note：1:isorhamnetin;2:quercetin;3:(-)-epigallocatechin;4:rutin;5:(-)-gallocatechingallate;6:naringenin;7:(-)-epicatechingallate;8:luteolin;9:naringin;10:L-epicatechin； “-”:undetected；Totalcontent：sumofcontentsoftenflavonoids；Totalcontentofmailflavonoids:sumofcontentsof(-)-gallocatechingallate,(-)-epicatechingallate,rutinandquercetin.

3 结论

本研究建立了一种基于高效液相色谱-串联质谱法同时测定沙棘种子和叶子中11种黄酮物质的定量分析方法。将所建立的方法用于11份沙棘种质样品分析发现，不同种质不同器官之间的黄酮类物质含量相差很大，叶片中10种黄酮总含量明显高于种子。本方法简便快速、准确可靠、覆盖面广，可作为一种高通量快速测定沙棘种子和叶片中黄酮类化合物的方法，对沙棘种质资源的选择和开发利用具有重要意义。